Cambios del periodo refractario efectivo auricular y de la I KACh tras estimulación vagal más estimulación eléctrica rápida en venas pulmonares

INTRODUCCIÓN

Estudios experimentales y clínicos recientes han establecido el papel del sistema nervioso autónomo, y en especial el del sistema nervioso parasimpático, en la patogenia de la fibrilación auricular (FA)^1-4.

Sin embargo, son pocos los estudios que se han centrado en la relación entre el tono parasimpático y la recuperación tras el remodelado eléctrico. Blaauw et al⁵ indicaron que el tono vagal aumentado se asociaba a un periodo refractario efectivo auricular (PREA) corto tras la estimulación eléctrica rápida y que había una recuperación prolongada tras el remodelado en experimentos realizados en cabras. Miyauchi et al⁶ demostraron que el bloqueo del sistema parasimpático puede facilitar la recuperación temprana tras el remodelado eléctrico asociado al marcapasos rápido a corto plazo. Sin embargo, en otro estudio, Takei et al⁷ observaron que la estimulación vagal (EV) previa a una estimulación eléctrica rápida evitaba que se produjera el remodelado eléctrico. En general, se acepta que la EV está mediada por receptores regulados por la liberación de Ach y activa la corriente de potasio regulada por Ach (I_KACh) en la aurícula: por consiguiente, se produce un acortamiento del PREA, la duración del potencial de acción (DPA) auricular, y eso potencia la dispersión del PREA (dPREA), y se inicia la FA^8,9. Los cambios de las propiedades eléctricas auriculares (remodelado eléctrico) se asocian a la activación de la I_KACh. Así pues, nuestra hipótesis es que el efecto del tono vagal en el remodelado eléctrico auricular tiene relación con las densidades de I_KACh. Con objeto de estudiar el mecanismo del efecto del tono vagal en el remodelado eléctrico, estudiamos los cambios del PREA y la I_KACh tras la EV y la estimulación eléctrica rápida en la vena pulmonar superior izquierda (VPSI) y analizamos la relación entre el tono parasimpático y la recuperación tras el remodelado eléctrico.

MÉTODOS

Animales de experimentación

Se utilizaron para el estudio 24 perros de un peso comprendido entre 15 y 22 kg (media, 20 ± 3 kg). Se les anestesió con pentobarbital sódico por vía abdominal (30 mg/kg) y se les ventiló con aire ambiental. Tras practicarles una esternotomía media, se expuso el corazón en la cavidad pericárdica. Se seccionaron los troncos vagales cervicales dobles para impedir la llegada de toda actividad nerviosa tónica al corazón. Se efectuó un registro de ECG continuo utilizando derivaciones II y aVf.

Determinaciones de parámetros electrofisiológicos

Se aplicaron las tres sondas de electrodo preparadas específicamente para el estudio, con un operador de electrodo (UNM-1, Japón), en las superficies epicárdicas de las aurículas derecha e izquierda y en la VPSI. Se fijaron electrodos de referencia en la pared torácica. El PREA se determinó con un instrumento LEAD-2000B (Sichuán, China). Los electrogramas de las sondas de electrodo se filtraron a 30-500 Hz. El calibrado del filtro de ECG fue de 0,1 a 250 Hz. Los intervalos S₁-S₂ se redujeron del valor inicial de 150 ms hasta la refractariedad, inicialmente mediante decrementos de 10 ms (S₁:S₂ = 8:1). Cuando los intervalos S₁-S₂ se aproximaban al PRE, estos decrementos se redujeron a 5 ms. Se añadió un estímulo adicional (S₂) en una fase tardía de la diástole auricular, y el intervalo entre S₁ y S₂ fue reduciéndose de 5 en 5 ms hasta que no se producía una respuesta auricular propagada. Se tomó como PREA local el intervalo de acoplamiento S₁-S₂ más largo que no lograba producir una respuesta auricular propagada.

Protocolo experimental

Se utilizaron para el estudio 24 perros, divididos en 3 grupos de 8 animales cada uno: grupo control, grupo de estimulación eléctrica y grupo de EV+EE.

En el grupo control, la EV se realizó mediante la introducción de cables de plata en el extremo craneal derecho del tronco vagosimpático en dirección al corazón del perro. A continuación se aplicó la estimulación eléctrica a una frecuencia de 20 Hz, y con un pulso de 0,2 ms de duración (estimulador de electrofisiología SEN-7103, Japón). El voltaje elegido para la EV fue de 5 V por encima del voltaje al que se alcanzaba un paro sinusal de una duración > 2 s. Este protocolo de estimulación se denominó EV₁. Durante el mismo periodo se estudió la inducibilidad de FA. Cuando se inducía una FA, se daba por finalizada la EV₁. Si la duración de la EV₁ era de 15 s y no se inducía una FA, se daba por finalizada también la estimulación del vago (fig. 1).

Fig. 1. Descripción del protocolo experimental.

En el grupo de EE, se aplicó estimulación eléctrica en la VPSI a 8 perros, a una frecuencia de 500 lat/min durante 4 h. Se determinó el PREA en la aurícula derecha (AD), la aurícula izquierda (AI) y la VPSI, antes y después de la aplicación de la estimulación, tras lo cual se aplicó la EV₁ y se determinó de nuevo la inducibilidad de FA.

En el grupo de EV+EE, se introdujeron cables de plata en los troncos vagosimpáticos derechos en dirección a los corazones de los animales. Tras la determinación del PREA, se aplicó EV a una frecuencia de 5 Hz, con un pulso de 0,2 ms de duración y a un voltaje de 5-10 V durante 30 min. Este protocolo de estimulación se denominó EV₂. Elegimos una frecuencia de estimulación inferior para EV₂ con objeto de evitar el bloqueo auriculoventricular de segundo o tercer grado y permitir que el ritmo del marcapasos auricular se condujera al ventrículo durante la EV₂. A continuación se aplicó a la VPSI un ritmo de marcapasos rápido de 500 lat/min durante 4 h. Tras el cese de la aplicación del marcapasos, se determinó el PREA y se investigó nuevamente la inducibilidad de FA durante la EV₁. Se calculó la dPREA obteniendo la diferencia entre el PREA máximo y el mínimo de tres valores del PREA registrados al mismo tiempo.

Técnicas de patch-clamp

Después de las determinaciones electrofisiológicas, se extrajeron los corazones de los animales y se sumergieron en suero salino fisiológico normal a temperatura de 0 °C. Se disecaron tejidos procedentes de la AD, la AI y la VPSI y se colocaron de inmediato en tres vasos de precipitado distintos, con contenido de solución Tyrode libre de Ca⁺ (30 ml) que contenía unas concentraciones (mmol) de 136 NaCl, 5,4 KCl, 1 MgCl₂, 0,33 NaH₂PO₄, 10 glucosa y 5 HEPES (pH 7,4) con O₂ al 100% y a temperatura de 37 °C. Se obtuvieron miocitos auriculares aislados utilizando el método de dispersión descrito con anterioridad¹⁰. En total, se tardó 1 h en aislar las células. Se aislaron muchas células viables de cada una de las tres zonas, pero solamente se utilizaron una o dos células para la técnica de patch-clamp, que requirió unas 2 h.

En este estudio se utilizó la configuración de célula completa para la técnica de patch-clamp. Se perfundieron las células aisladas con la solución Tyrode con el siguiente contenido (mmol): 136 NaCl, 5,4 KCl, 1 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 glucosa y 10 HEPES (pH 7,4). Solución de pipeta: 110 aspartato potásico, 20 KCl, 1 MgCl₂, 5 Mg-ATP, 0,1 GTP, 10 EGTA, 5 fosfocreatina, 10 HEPES, pH ajustado a 7,3 con KOH. Los pulsos de órdenes se generaron con un convertidor controlado con el programa informático Pulse+Pulsefit (Heka Instruments, Alemania). Los potenciales de la unión se fijaron a cero antes de la formación del cierre hermético de membrana-pipeta en la solución Tyrode. La capacitancia y la resistencia en serie se compensaron eléctricamente para reducir al mínimo la duración del crecimiento de capacitancia al registrar la corriente y la caída del voltaje entre los dos lados de la membrana celular «clampada». Se rechazaron las células que presentaron pérdidas del potencial transmembrana (indicada por cambios de más de 10 pA en el mantenimiento de la corriente con -50 mV). Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura de 32 ± 1 °C.

Para el registro de la I_KACh, se inhibieron otros subtipos de receptores colinérgicos muscarínicos con el empleo de los siguientes antagonistas con selectividad para subtipos: pirenzepina (100 nmol, un bloqueador de M₁), 4-DAMP (2 nmol, un inhibidor de M₃) y tropicamida (200 nmol, un inhibidor de M₄). La I_KACh se indujo con 1 μmol ACh y los registros de I_KACh se realizaron generalmente con dofetilida (1 μmol) y cromanol 293B (20 μmol) en la solución de baño para bloquear la I_Kr y la I_Ks. Se evitó la contaminación por corriente de sodio manteniendo la célula a -50 mV. Se utilizó cloruro de cadmio (200 μmol) para inhibir la corriente de Ca²⁺, así como la corriente de cloruro activada por Ca²⁺. La corriente de K⁺ sensible a ATP, si la había, se suprimió con gliburida (10 μmol) en el líquido de perfusión y mediante 5 mmol Mg-ATP en la pipeta¹¹. La I_KACh se indujo con ACh (1 μmol) en la solución del baño y se definió como la corriente sensible a atropina (1 μmol), con objeto de descartar la contaminación producida por la corriente de K⁺ de entrada retrógrada compensadora (I_K1).

Análisis estadístico

Los valores se presentan en forma de media ± error estándar de la media. Se utilizó para el análisis el programa informático de estadística SPSS. Las comparaciones estadísticas se realizaron con un ANOVA. Se efectuaron comparaciones de datos apareados y no apareados utilizando la prueba de la t de Student; las incidencias de FA se compararon con la prueba exacta de Fisher. Se tomó como umbral de significación estadística un valor de p < 0,05.

RESULTADOS

Inducción de FA

En el grupo control, se indujo una FA en 1 de los 8 animales estudiados. La duración de esta FA fue de 5 s. En el grupo de EE, se indujo una FA en los 8 animales, y su duración fue de más de 10 s. En el grupo de EV+EE, se indujo una FA en 2 animales. La duración de la FA fue de 4 s en 1 animal y 5 s en el otro. La incidencia de FA inducida y la duración de la FA en el grupo de estimulación fueron superiores a lo observado en el grupo de control y en el grupo de EV+EE (p < 0,05); sin embargo, no hubo una diferencia significativa entre el grupo control y el grupo de EV+EE (tabla 1).

Cambios del PREA y la dPREA

En los grupos en los que se utilizó estimulación eléctrica, el PREA se redujo notablemente en todas las localizaciones examinadas y la dPREA aumentó de forma significativa (11 ± 3 ms frente a 32 ± 5 ms; p < 0,05), respectivamente. Sin embargo, en el grupo de EV+EE, el PREA no se modificó de manera significativa tras la aplicación de la estimulación eléctrica, mientras que la dPREA aumentó también significativamente (10 ± 3 ms frente a 30 ± 5 ms; p < 0,05) (tablas 2 y 3).

Correlación entre estimulación eléctrica y densidad de I_KACh

Se determinó la amplitud de la I_KACh utilizando la media de las corrientes al final de los pasos de voltaje de 2 s tras el inicio de dichos pasos. Tal como se muestra, en el grupo control, las densidades de I_KACh fueron sustancialmente inferiores en las células de la VPSI que las observadas en los miocitos auriculares, para todos los potenciales examinados. Además, las densidades de I_KACh en los miocitos de la aurícula derecha fueron menores que en los de la aurícula izquierda (AI, AD frente a VPSI: -14 ± 0,58, -10 ± 0,63 frente a -7 ± 0,42 pA/pF; p < 0,05). En el grupo de EE, las densidades de I_KACh aumentaron en todas las localizaciones estudiadas (VPSI, -17 ± 0,61 frente a -14 ± 0,58 pA/ pF; AI, -13 ± 0,57 frente a -10 ± 0,63 pA/pF; AD, -11 ± 0,53 frente a -7 ± 0,42 pA/pF; p < 0,05). Sin embargo, en el grupo de EV+EE, las densidades de I_KACh presentaron una tendencia decreciente en la AI, la AD y la VPSI, aunque sin alcanzar significación estadística (-12 ± 0,42 frente a -14 ± 0,58 pA/ pF, -9 ± 0,51 frente a -10 ± 0,63 pA/pF; -6 ± 0,37 frente a -7 ± 0,42 pA/pF; p > 0,05) (figs. 2 y 3).

Fig. 2. A: comparación de I_KACh en AI, AD y VPSI en el grupo control. Se aplicaron pasos de voltaje de 2 s para provocar la I_KACh con potenciales de entre -100 y +50 mV. Se aplicaron los mismos protocolos de voltaje que en las figuras siguientes. La I_KACh se activó en presencia de 1 μmol ACh. La línea a trazos indica el nivel cero. B: relaciones de densidad de corriente-voltaje de las corrientes (n = 6 células para AI, n = 6 células para AD, n = 7 células para VPSI). La I_KACh se determinó al final de los pulsos de 2 s. La densidad de I_KACh en la AI y la AD es superior a la existente en la VPSI. Además, la densidad de I_KACh es mayor en la AI que en la AD. AD: aurícula derecha; AI: aurícula izquierda; VPSI: vena pulmonar superior izquierda.

Fig. 3. A: comparación de I_KACh en AI, AD y VP entre el grupo de estimulación eléctrica y el grupo de EV+EE. Se aplicaron pasos de voltaje de 2 s para provocar la I_KACh, con potenciales comprendidos entre -100 y +50 mV. La I_KACh se activó en presencia de 1 μmol ACh. La línea a trazos indica el nivel del cero. B: relaciones de densidad de corriente-voltaje de las corrientes en la VPSI (n = 7 células para el grupo control, n = 6 células para el grupo de EE en la VPSI, n = 7 células para el grupo de EV más EE en VPSI). La I_KACh se determinó al final de los pulsos de 2 s. En el grupo de EE, la densidad de I_KACh es superior a la del grupo de EV. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en el grupo de EV y el grupo de EV+EE. AD: aurícula derecha; AI: aurícula izquierda; VPSI: vena pulmonar superior izquierda.

DISCUSIÓN

Los resultados de este estudio indican que: a) antes de la EE rápida, la EV puede inhibir la vulnerabilidad a la FA, b) la aplicación de un marcapasos rápido con descargas en la VPSI aumenta las densidades de I_KACh en la aurícula y la VPSI, mientras que la EV antes de la aplicación de la EE inhibe los cambios de la I_KACh. Estos resultados indican que el efecto del marcapasos rápido en el remodelado eléctrico auricular tiene relación con un aumento de la I_KACh.

Estudios recientes han señalado que el nervio vago desempeña un papel importante en la aparición del remodelado eléctrico auricular con un ritmo de marcapasos rápido y la recuperación posterior^5,7. Este estudio indica que un aumento del tono vagal junto con el remodelado eléctrico podría actuar de manera sinérgica para acortar el periodo refractario y fomentar la aparición de una FA. De forma análoga, Miyauchi et al⁶ pusieron de relieve que el bloqueo parasimpático con atropina fomentaba la recuperación tras el remodelado eléctrico auricular inducido por un estímulo de marcapasos auricular de corta duración en el ser humano. Sin embargo, Takei et al⁷ pusieron de manifiesto que la estimulación vagal previa a la estimulación auricular rápida impedía que se produjera el remodelado eléctrico. Tal vez los resultados diferentes indicaran que el tono vagal tiene efectos diferentes en el remodelado eléctrico antes y después de la aplicación de un marcapasos auricular rápido.

Los datos de otros estudios han mostrado un notable acortamiento del DPA y la formación de postpotenciales precoces en manguitos de vena pulmonar en perfusión cuando se los expone a acetilcolina o noradrenalina o con la estimulación eléctrica local^12,13. Las activaciones rápidas dentro de las venas pulmonares son importantes en los mecanismos de producción de la FA. La VPSI es un origen frecuente de estas activaciones rápidas durante la FA¹⁴. Al investigar el efecto de la EV sobre el remodelado eléctrico antes de la estimulación eléctrica rápida en la VPSI, observamos cambios diferentes del PREA tras la EV más estimulación rápida en la VPSI. Tras la aplicación de estimulación rápida sin EV, se producía una disminución brusca del PREA y un aumento de la dPREA, con un cambio significativo. Sin embargo, tras la EV más EE, el PREA no cambiaba de manera significativa, mientras que la dPREA sí aumentaba significativamente. La FA inducida y la duración de la FA en el grupo de EE fueron superiores a lo observado en el grupo control y en el grupo de EV+EE; sin embargo, no hubo diferencias significativas entre el grupo control y el grupo de EV+EE. Los resultados indicaron que el empleo de EV más estimulación rápida en la VPSI podría proteger contra la reducción del PREA, pero no aportaría una protección completa de la aurícula contra el remodelado eléctrico. Es bien sabido que la heterogeneidad de la inervación auricular contribuye a producir la capacidad del EV de iniciar una FA de reentrada al aumentar la dispersión de la refractariedad en la aurícula^15-17. En este estudio, los resultados obtenidos indicaron que el simple aumento de la dPREA no bastaba para inducir la FA, sino que era más bien la disminución del PREA lo que constituía la base de la inducción de la FA.

Varios estudios han puesto de manifiesto una distribución diferente de la I_KACh en la aurícula y en las venas pulmonares^14,18-20. La taquicardia auricular crónica con frecuencias en la gama de FA produce cambios importantes de la función de los canales iónicos (reducción de las densidades de corriente de salida de K⁺ transitoria I_to, corriente de Ca²⁺ de tipo L I_Ca, y corriente de Na⁺ I_Na) que crean un sustrato funcional que facilita el mantenimiento de la FA^21-24. En la FA humana crónica, Dobrev et al²⁵ demostraron que la regulación negativa de la I_KACh atenúa el acortamiento del DPA mediado por receptores muscarínicos. Además, en su otro estudio, estos autores demostraron que la mayor corriente de entrada de K⁺ rectificadora basal en la FA crónica se debe a un aumento de la actividad de I_K1 y a la I_KACh activa de forma constitutiva²⁶. Estos resultados indicaron que el acortamiento del PREA debido a un remodelado eléctrico era contrarrestado por la regulación negativa de la I_KACh.

En el presente estudio, hemos observado las densidades de I_KACh en diferentes localizaciones y en diferentes condiciones. Los resultados pusieron de manifiesto que, tras la aplicación de estimulación eléctrica, las densidades de I_KACh aumentaban en la VPSI, la AI y la AD. No se sabe por qué mecanismos las densidades de I_KACh cambian con el marcapasos auricular rápido o la FA sostenida. Dobrev et al señalaron que los miocitos auriculares se adaptan a una frecuencia crónicamente elevada mediante una regulación negativa de la I_KACh con objeto de contrarrestar el acortamiento del PREA debido al remodelado eléctrico. Sin embargo, nuestros datos indicaron que, tras 4 h de marcapasos rápido, las densidades de I_KACh estaban aumentadas. Tras una EV más estimulación eléctrica, observamos que no había diferencias de I_KACh entre el ritmo sinusal y tras la EV previa a la estimulación eléctrica. Este remodelado de la I_KACh puede explicar por qué la EV más estimulación protegió la aurícula contra el remodelado eléctrico auricular. En nuestro estudio previo, observamos que la EE rápida en venas pulmonares inducía una disminución de las densidades de I_Ca,L e I_to²⁷. Que nosotros sepamos, actualmente no se conoce qué elementos esenciales son necesarios para este proceso. Un estudio reciente ha indicado que la I_to en la aurícula del conejo sufre una depresión tras una estimulación auricular rápida de corta duración, pero se recupera tras aplicaciones más largas²⁸. Se deberá estudiar con mayor detalle la evolución temporal del remodelado de I_KACh cuando se producen oscilaciones.

Limitaciones del estudio

Se sabe que el pentobarbital prolonga el PREA en comparación con lo que ocurre cuando no hay anestesia y que afecta al tono nervioso simpático y parasimpático, y ello podría ser una limitación de este estudio. Todos los perros fueron autocontrolados y recibieron iguales dosis y el mismo tipo de anestésico, y el pentobarbital sódico tiene un efecto débil en los nervios del sistema autónomo en comparación con la EV. En nuestro estudio, observamos los cambios del PREA y la I_KACh después de tan sólo 4 h de aplicación de la estimulación eléctrica prolongada. El efecto en la I_KACh de una aplicación prolongada de EE puede aportar resultados diferentes y deberá ser investigado con mayor detalle.

Además, no examinamos la actividad de I_KACh después de la EV (frecuencia de 5 Hz, con una duración del pulso de 0,2 ms a 5-10 V) durante 30 min, y la EV continua durante un marcapasos rápido podría haber producido unos resultados diferentes. Por último, este estudio no abordó la cuestión del tiempo necesario para influir en la I_KACh ni las variables hemodinámicas durante el marcapasos rápido. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en cuanto a edema periférico o temperatura cutánea entre los dos grupos. Se deberá estudiar con mayor detalle si el tono vagal influye en la I_KACh y el efecto de las variables hemodinámicas en el tono vagal.

CONCLUSIONES

La disminución del PREA puede ser fundamental, pero por sí sola no causa la inducción colinérgica de la FA. El marcapasos rápido en la VPSI aumentó la I_KACh. La EV antes de la EE rápida protege en parte las aurículas contra el remodelado eléctrico.

ABREVIATURAS

AD: aurícula derecha.

AI: aurícula izquierda.

dPREA: dispersión del PREA.

EE: estimulación eléctrica.

EV: estimulación vagal.

FA: fibrilación auricular.

PREA: periodo refractario efectivo auricular. VPSI: vena pulmonar superior izquierda.

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VÉASE EDITORIAL EN PÁGS. 729-32

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Correspondencia:

Dr. Qingyan Zhao.

Cardiovascular Research Institute of Wuhan University. Renmin Hospital of Wuhan University. 238 Jiefang Road. Wuchang. Wuhan City. 430060 República Popular China.

Correo electrónico: [e-mail]

Recibido el 2 de diciembre de 2008.

Aceptado para su publicación el 18 de febrero de 2009.