Métodos: Analizamos la fracción de acortamiento de la zona isquémica (dependiente de arteria descendente anterior), periisquémica y control (dependiente de arteria circunfleja), implantando cristales ultrasónicos en 17 perros mestizos. En la serie control, con un miocardio «virgen», medimos los efectos de una isquemia parcial (reducción del flujo coronario un 30-60% del basal) y transitoria (15 min) sobre la función miocárdica regional. En otras 2 series, el miocardio fue previamente aturdido-precondicionado mediante isquemias breves y repetidas. Después, los días 5 (serie B) y 15 (serie C), los perros fueron sometidos a una isquemia similar a la de la serie control. Resultados. Tras comparar los resultados con la serie control, observamos cómo la fracción de acortamiento de la zona isquémica se redujo hasta un 107% (p < 0,01) durante la isquemia parcial, cuando esta se indujo el día 5 del aturdimiento-precondicionamiento (serie B). Conclusiones. En el perro, las isquemias breves y repetidas pueden condicionar la función contráctil, de forma que una posterior reducción parcial y transitoria del flujo coronario puede inducir una severa afectación de la contractilidad expresada como un área de discinesia.
Palabras clave
INTRODUCCION
El precondicionamiento se detectó por primera vez en experimentos diseñados para deplecionar miocitos de trifosfato de adenosina empleando episodios breves y repetidos de isquemia intercalados con períodos de reperfusión 1 . Sobre la base de estos hallazgos, Murry et al 2 diseñaron un experimento que demostró que la inducción de isquemias breves separadas por períodos de reperfusión reducía el tamaño de la necrosis ocasionada por una isquemia posterior sostenida. A partir de aquí, Murry acuñó el término precondicionamiento isquémico definiéndolo como «una respuesta rápida y adaptativa a una isquemia breve, que enlentece la tasa de muerte celular durante un posterior período de isquemia prolongada».
Desde este trabajo original han sido numerosísimos los estudios realizados acerca de este nuevo concepto en cardioprotección experimental habiéndosele atribuido las siguientes características: a) se asocia a una tasa reducida de pérdida de trifosfato de adenosina 2 ; b) no depende de un aumento del flujo por circulación colateral 2 , habiendo sido observado este fenómeno en especies como ratas 3 , conejos 4 y cerdos 5 , que poseen escasa o nula circulación colateral; c) tan sólo una breve oclusión previa a un período mayor de isquemia puede precondicionar el corazón 6,7 ; d) el efecto citoprotector del precondicionamiento puede perderse cuando la duración de la isquemia sostenida se eleva por encima de los 90 min a 3 h en los modelos animales 2,8 ; e) puede aparecer una tolerancia al precondicionamiento con abolición de su efecto beneficioso cuando se realizan un exceso de isquemias breves y repetidas en el protocolo precondicionante 9 ; f) otras formas diferentes de estrés pueden tener un efecto precondicionante, entre las que se incluyen la hipoxia 10 , el calor 11 y la estimulación alfaadrenérgica 12,13 , y g) Marber et al en conejos 14 y el grupo de Kuzuya en perros 15 han descrito una segunda fase de protección frente a la necrosis que reaparece 24 h después del episodio isquémico precondicionante inicial. Así, la protección aparece poco después del episodio isquémico precondicionante, disminuye tras varias horas y retorna un día después en algunas especies. Esta segunda ventana de protección ha sido descrita también posteriormente en otros modelos animales como la rata 16 ; sin embargo no se ha encontrado en el cerdo 17 , y su mecanismo parece depender de mediadores distintos de los responsables del precondicionamiento «inmediato».
Aunque el verdadero estándar de citoprotección por precondicionamiento es la reducción del tamaño de la necrosis, algunos autores han comunicado la mejoría de la función contráctil 18-20 y la disminución de arritmias ventriculares malignas 17,21 , si bien estos dos aspectos permanecen en discusión. El objetivo del presente trabajo es valorar el efecto de una isquemia miocárdica ligera y transitoria sobre la función contráctil regional de un territorio que previamente ha sido sometido a múltiples episodios breves de isquemia-reperfusión.
MÉTODOS
Protocolo isquémico y series experimentales
Se utilizaron 17 perros mestizos (peso medio 22,2 kg), de ambos sexos, sanos y bajo control veterinario, distribuidos en 3 series. Una serie control (serie A) de 6 perros, con un miocardio «virgen», que fueron sometidos a una isquemia parcial (reducción del flu-
jo coronario entre un 30-60% del basal) y transitoria (15 min de duración) de la arteria descendente anterior (ADA); y otras 2 series sometidas primero a un protocolo consistente en 20 obstrucciones completas (reducción del flujo coronario del 100%) de 2 min de duración separadas por 3 min de reperfusión en la ADA (protocolo de aturdimiento/precondicionamiento), y a los 5 días (serie B) o a los 15 días (serie C), se realizó una isquemia de características similares a la de la serie control (fig. 1). La serie B estaba constituida por 5 perros y la serie C por 6, de los que sólo fueron válidos 5 dado que uno de ellos murió por disociación electromecánica al inducir la anestesia durante la segunda intervención quirúrgica.
Sabemos, por estudios previos 22 , que el protocolo de 20 obstrucciones breves y repetidas provoca un aturdimiento de la zona isquémica que es máximo el día 5 del mismo y se ha recuperado completamente el día 15; por este motivo se indujo la obstrucción parcial y transitoria en estos momentos concretos de la evolución temporal del miocardio aturdido.
En todos los casos se ha cumplido la normativa sobre protección de animales destinados a experimentación (R.D. 223/1988).
El presente protocolo ha sido aprobado por el Comité de Ensayos con Animales de Experimentación del Centro de Investigación del Hospital Universitario La Fe de Valencia.
Preparación experimental
Protocolo de precondicionamiento
Los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (30 mg/kg) y cloruro mórfico (0,01 g por cada 5 kg) y durante el experimento se mantuvo una perfusión continua de succinilcolina (0,4 mg/h). Los perros fueron intubados y ventilados mecánicamente (respirador volumétrico Temel de rotámeros paralelos) respirando una mezcla de protóxido de hidrógeno y oxígeno. Se monitorizó el electrocardiograma mediante electrodos-aguja subcutáneos (conectados a un polígrafo de 8 canales Hewlett-Packard 7758 de inscripción térmica y a un osciloscopio de 2 canales Hewlett-Packard 1201B para visualización continua de señales). Se realizó toracotomía lateral izquierda a través del quinto espacio intercostal y tras pericardiotomía se procedió a la disección de la ADA en su tercio proximal, situando a su alrededor un medidor electromagnético de flujo (Flowprobe implantable perivascular Serie S conectado a un medidor de flujo Modelo T206 de Transonic Systems Inc.) que se mantuvo durante todo el experimento, y un lazo que facilita la posterior oclusión mediante un clamp vascular. Para la medición de las longitudes telediastólica (LTD) y telesistólica (LTS) y de la fracción de acortamiento sistólico (FAc) se utilizó un medidor ultrasónico de movimiento (Ultrasonic Dimension System modelo 401 de Schuessler and associates y osciloscopio Tektronics 2236 de 2 canales) y se implantaron 3 pares de microcristales piezoeléctricos (Segment Length Xducer P/N SL 5-2 Triton Technology Inc.), uno en la zona isquémica, otro en la zona periisquémica y un tercero en la zona testigo correspondiente a territorio irrigado por la arteria circunfleja (ACX). Por último, se introdujo un catéter en ápex de ventrículo izquierdo para monitorización de la presión intraventricular (catéter transductor de presión Microtip Millar y transductores de presión Hewlett-Packard Quartz Transducer 1290A). A continuación se realizaron las 20 isquemias con sus correspondientes reperfusiones como se han descrito previamente, y después se procedió al cierre del tórax, retirándose el medidor de flujo periarterial y el catéter de presión del ápex ventricular y dejándose implantados los microcristales subendocárdicos con lo que aseguramos que durante la segunda intervención las zonas analizadas son exactamente las mismas. Por último, y una vez despiertos los animales, se les administra una dosis de analgesia (metamizol magnésico) y de antibióticos (penicilina G y gentamicina), pasando posteriormente al estabulario en jaulas individuales. Se les administran dosis adicionales de 80 mg de gentamicina durante 2 días consecutivos y otra dosis de penicilina G al cuarto día de la intervención.
Isquemia parcial y transitoria
La preparación experimental es similar a la descrita para el protocolo de precondicionamiento, con la salvedad de que los cristales ultrasónicos ya están implantados y antes del experimento tan sólo resta comprobar su correcto funcionamiento. A continuación se realiza la isquemia de las características ya reseñadas y tras la finalización del correspondiente período de reperfusión se procede al sacrificio de los animales mediante electroestimulación directa sobre la pared miocárdica, provocando la muerte por fibrilación ventricular.
Parámetros analizados
Los parámetros analizados fueron: flujo coronario, frecuencia cardíaca, presión sistólica y telediastólica del ventrículo izquierdo, derivada de la presión ventricular izquierda (dP/dt) y LTD, LTS y FAc definida como (LTD LTS/LTD * 100). Estas variables fueron determinadas en situación basal, a los 5, 10 y 15 min de isquemia y a los 5 y 15 min de reperfusión. Excepto el flujo coronario, cuyo valor aparece reflejado de forma continua en la pantalla digital del medidor de flujo, el resto de parámetros son registrados mediante impresión en papel y posterior lectura manual de los mismos.
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se consideran los valores promedio de cada situación y su desviación estándar. La comparación entre las medias se ha realizado mediante la prueba de la t de Student y el análisis de la variancia (ANOVA). Se aplicó el test de Newman-Keuls para comparaciones múltiples justificado por el análisis de la variancia. Una p < 0,05 fue considerada estadísticamente significativa. Los valores en tablas, figuras y texto se expresan como media ± desviación estándar. Se comparan los valores obtenidos respecto a la situación basal en cada una de las series y los valores de la FAc de las series precondicionadas durante la isquemia transitoria respecto a los de la serie control.
RESULTADOS
Efecto del protocolo de precondicionamiento/aturdimiento
En la serie B la FAc en la zona isquémica antes del protocolo de precondicionamiento era de 12,6 ± 1,8; tras éste era de 8,3 ± 1,7, es decir, una disminución de la misma de un 34,2% (p < 0,05) y al quinto día de dicho protocolo la FAc era de 3,6 ± 0,8, lo que equivale a un descenso de un 71,5% (p < 0,01). En la zona testigo la FAc fue de 15,8 ± 1,9 antes del precondicionamiento; de 16,1 ± 4,5 después de éste (p = NS) y de 14,1 ± 2,1 al quinto día del mismo (p = NS).
En la serie C la zona isquémica presentaba una FAc de 14,7 ± 3,0 antes del precondicionamiento; de 10,6 ± 1,7 después del mismo (p < 0,05), lo que equivale a una disminución del 27,9%, y de 13,8 ± 1,1 a los 15 días del protocolo de recondicionamiento (p = NS). En cuanto a la zona testigo los valores de la FAc antes y después del precondicionamiento fueron, respectivamente, de 12,6 ± 4,7, de 12,9 ± 3,3 (p = NS) y de 12,4 ± 2,5 a los 15 días (p = NS).
Efecto de la isquemia parcial
No hubo diferencias estadísticamente significativas en los diferentes parámetros hemodinámicos, entre las series con precondicionamiento previo (B y C) respecto a la control. El flujo coronario se redujo durante los 15 min de isquemia de forma similar en todas las series, con una reducción entre el 30 y 60% del flujo basal, como marcaba el protocolo experimental, lo que fue significativo en cada serie respecto a su valor basal (tabla 1). En las tablas 2 y 3 se exponen los valores de función miocárdica regional de las 3 series con significaciones estadísticas de cada serie respecto a su basal.
La comparación de la FAc entre las diferentes series se realizó de forma porcentual considerando que la situación basal constituye un acortamiento del 100%; esto fue así porque la FAc al inicio de la obstrucción parcial era muy dispar entre las 3 series dado que las series B y C habían sido sometidas previamente a un precondicionamiento-aturdimiento. La isquemia parcial y transitoria realizada al quinto día del protocolo precondicionante (serie B) provocó una severa depresión de la función contráctil regional con una discinesia importante de la zona isquémica al compararla con la serie control (p < 0,01) (fig. 2). En la zona periisquémica no se observaron diferencias significativas entre las series precondicionadas respecto a la control. Por último, la zona testigo de todas las series presentó una tendencia a la hipercontractilidad aunque tuvo significación estadística tan sólo en la serie C a los 5 min (p < 0,01) y a los 10 min (p < 0,05) del inicio de la oclusión (fig. 3).
DISCUSION
Los conocimientos actuales indican que los efectos del precondicionamiento en la recuperación de la función contráctil dependen de la menor necrosis ocasionada. Si además el precondicionamiento tiene un efecto beneficioso independiente en el curso de la recuperación funcional del tejido perinecrótico continúa siendo desconocido. En el presente estudio intentamos responder a la pregunta de si las obstrucciones coronarias breves y repetidas que no llegan a producir necrosis 22 , pero sí aturdimiento miocárdico regional, condicionan de alguna forma a ese miocardio ante isquemias posteriores.
Durante algunos años se mantuvo la incógnita de si el fenómeno del precondicionamiento se debía al aturdimiento provocado por las isquemias breves y repetidas, sin embargo, pronto se observó que existía una disociación en el curso temporal de ambos fenómenos 23, 24 , el precondicionamiento podía ser inducido por una isquemia tan ligera y breve que no provocase un aturdimiento 6 y, además, la inhibición farmacológica de uno de los dos fenómenos no implicaba la interferencia en la evolución del otro 25 . Por tanto, pronto quedó descartado que el precondicionamiento fuera una consecuencia del aturdimiento.
Aunque se ha utilizado el perro para el presente proyecto, y sabemos que este animal es el de mayor circulación colateral basal de todos los animales de tamaño medio utilizados en cardiología experimental, pensamos que este dato no tiene influencia en los resultados de este estudio dado que trabajos previos 26,27 demuestran que se requieren oclusiones repetidas durante varios días o bien tiempos totales de isquemia mucho más prolongados a los realizados en este estudio para tener un estímulo suficiente de la angiogénesis que desarrolle una circulación colateral capaz de aportar los requerimientos metabólicos adecuados durante una posterior isquemia.
Según este estudio, y con el protocolo isquémico mencionado, las obstrucciones breves y repetidas de la ADA no preservan la función contráctil durante sucesivos episodios isquémicos transitorios. Estos resultados son similares a los obtenidos por Ovize et al 6 quienes aleatorizaron una serie de perros en tres grupos diferentes, previamente a provocarles una isquemia sostenida de 15 min: un grupo fue sometido a 2,5 min de oclusión coronaria seguida por 5 min de reperfusión; un segundo grupo fue sometido a una oclusión coronaria de 5 min con similar reperfusión; por último el tercer grupo no fue intervenido (grupo control). Inmediatamente antes de los 15 min de isquemia sostenida la FAc era del 101% de los valores basales en el grupo control, del 91% en el grupo precondicionado con oclusión de 2,5 min (p = NS frente a control) y del 55% en el grupo precondicionado con 5 min (p < 0,05 frente a control), sin embargo, todos los grupos mostraron el mismo grado de aturdimiento tras la isquemia sostenida y durante la reperfusión: a las 3 h de la misma la FAc permanecía deprimida entre un 24 y un 48% de los valores basales, y no había diferencias significativas entre los 3 grupos. Otros múltiples estudios realizados en perros 28-30 , en los que se valoró la disfunción postisquémica del tejido perinecrótico, y que habían sido sometidos a isquemias prolongadas que ocasionaban necrosis, aportaron similares resultados, es decir, la inexistencia de mejoría de la función contráctil con el precondicionamiento. Sin embargo, en algunos estudios realizados en vivo con conejos 19 y cerdos 20 y, en otros, en corazones aislados de rata 18 y conejos 31 , sí se ha referenciado una mejoría de la función contráctil con el precondicionamiento, aunque algunos factores, como distintos tiempos de reperfusión tras la isquemia sostenida, podrían estar detrás de estas discrepancias.
Consideramos importante destacar que en los resultados obtenidos en este estudio se observa que las oclusiones coronarias breves y repetidas no sólo no preservan la función contráctil ante isquemias posteriores, sino que incluso una oclusión coronaria muy leve que incide en el momento de máximo aturdimiento del miocardio es capaz de provocar una discinesia (p < 0,01 frente a control), es decir, existiría una especie de sensibilización, un «condicionamiento negativo» de la función contráctil. Podría darse entonces la paradoja de que el mismo procedimiento (isquemias breves intercaladas por episodios cortos de reperfusión) pudiese constituir un fenómeno beneficioso para el miocardio si fuese seguido de una isquemia prolongada capaz de ocasionar necrosis (reduciría el tamaño de la misma), o bien un fenómeno perjudicial si una isquemia no muy severa incidiese en el momento de máximo aturdimiento provocado (incrementaría la disfunción contráctil).
Desde Tennant y Wiggers 32 , quienes fueron pioneros en el estudio de los efectos de la isquemia sobre la función contráctil, conocemos los efectos inmediatos sobre la función regional de una oclusión coronaria completa aguda. A la discinesia provocada en la zona isquémica central, y a la hipocinesia o acinesia de la zona adyacente, se añadía una hiperfunción compensadora del miocardio normal no afectado. Este fenómeno lo observamos también en nuestras series donde la zona testigo incrementa su función durante la isquemia, sin embargo, llama la atención que esta hipercontractilidad sea mayor y significativa sólo en la serie C (cuando se ha recuperado el aturdimiento previamente provocado) y no en la B (durante el máximo aturdimiento), en la que existe mayor disfunción contráctil de la zona isquémica. Aunque este hecho es difícil de explicar, cabría la posibilidad, como han descrito algunos autores 30 , de que las oclusiones breves y repetidas pudieran precondicionar no sólo a los miocitos del territorio sometido a isquemia sino incluso a aquellos pertenecientes a otros territorios vasculares, y estar mediatizado este fenómeno por algún factor o factores activados, producidos o transportados a través del corazón durante las breves isquemias-reperfusión, es decir, podría existir una especie de «entrenamiento» en los territorios no isquémicos de tal forma que responderían con una mayor hipercontractilidad compensadora en episodios isquémicos subsiguientes.
Aunque las potenciales implicaciones clínicas de los resultados obtenidos en este estudio son difíciles de sugerir (dado que este modelo supone unas condiciones de isquemia repetida muy concretas y no refleja con fidelidad la isquemia de los pacientes coronarios) la observación de que una isquemia tan ligera sea capaz de provocar una disfunción contráctil tan importante (concretamente un área de discinesia que sólo se induce con oclusiones coronarias completas que generan isquemia total) podría explicar la diferente tolerancia hemodinámica a la angina observada en algunos pacientes dependiendo de la relación temporal con episodios anginosos o isquemias silentes previas ocurridas en ese paciente. Así mismo, podrían explicarse algunas situaciones vistas en pacientes en la fase precoz del postinfarto (miocardio aturdido), donde los episodios anginosos con poca traducción electrocardiográfica desencadenan en ocasiones situaciones de fallo ventricular izquierdo severo con signos clínicos de edema pulmonar y/o bajo gasto.
CONCLUSIONES
En perros, las isquemias breves y repetidas inducen un aturdimiento miocárdico de varios días de duración que es máximo al quinto día y durante el cual una reducción parcial y transitoria del flujo coronario induce una profunda afectación de la función contráctil, expresada por discinesia del segmento isquémico.