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Conceptos Generales
En el ámbito de las enfermedades cardiovasculares, la utilización de modelos animales ha contribuido sustancialmente al progreso en el conocimiento de su patogenia y ha permitido el desarrollo de técnicas diagnósticas y la validación de procedimientos preventivos y terapéuticos, tanto farmacológicos como intervencionistas1-8.
Aunque los modelos animales nunca se asemejan completamente a la realidad observada en la clínica, sí que permiten obtener información directa de determinados fenómenos, con un control adecuado de diversas variables y utilizando procedimientos precisos, con frecuencia invasivos y difícilmente aplicables en estudios clínicos. La información obtenida a partir de los modelos animales requiere el análisis de su aplicabilidad a la patología humana, y por ello la información obtenida en ambos contextos debe ser complementaria.
En la actualidad la experimentación animal es un requisito legal encaminado a garantizar la seguridad antes de introducir fármacos y diversos procedimientos diagnósticos y terapéuticos en la clínica. Por otra parte, existe una normativa y unos procedimientos de regulación de la experimentación cuya finalidad es evitar el sufrimiento de los animales durante el desarrollo de los estudios experimentales9,10.
La implementación de los medios necesarios para cumplir los requisitos establecidos y de los procedimientos de aprobación y control de los protocolos experimentales es preceptiva. Facilitar el desarrollo y la aceptación de métodos alternativos para demostrar determinadas hipótesis fisiopatológicas o terapéuticas, la comercialización de las técnicas relacionadas (p. ej., la producción in vitro de sustancias obtenidas a partir de modelos animales) y la incentivación de su utilización son medidas que pueden ayudar a desarrollar las condiciones de la experimentación con modelos animales.
Las principales ventajas de este tipo de modelos son la posibilidad de utilizar controles y de fijar las condiciones que podrían modificar los resultados al variar uno o varios factores (fig. 1). Entre las limitaciones se encuentran las diferencias existentes entre la enfermedad humana y la inducida experimentalmente como, entre otras, las diferencias en los mecanismos de regulación genética o en los factores que determinan las funciones cardiaca y vascular1 (fig. 2). Especies filogenéticamente distintas pueden presentar diferencias anatómicas importantes, pueden responder a mecanismos fisiopatológicos diferentes y los tratamientos farmacológicos pueden actuar de modo diverso. Por estos motivos, la extrapolación de los resultados de la investigación básica a la patología humana siempre se debe efectuar con cautela.
Fig. 1. Principales ventajas de los modelos animales utilizados en el estudio de las enfermedades cardiovasculares.
Fig. 2. Limitaciones de los modelos animales utilizados en la investigación sobre las enfermedades cardiovasculares.
Por otra parte, la distancia entre el laboratorio y la clínica en ocasiones implica que no se perciba con claridad la utilidad de los resultados de un determinado estudio. Para acortar esa distancia hay que desarrollar los eslabones intermedios que acerquen los resultados de un descubrimiento básico al quehacer diario encaminado a prevenir, diagnosticar o tratar las enfermedades cardiovasculares. También hay que transmitir al científico básico las inquietudes surgidas de la práctica clínica, los problemas no resueltos o las limitaciones observadas, para señalar las lagunas existentes y procurar orientar los esfuerzos de la investigación básica hacia la resolución de estos problemas. La comunicación y la discusión científica en el seno de equipos multidisciplinarios es necesaria para mejorar los resultados de la investigación que en última instancia debe encaminarse hacia el mejor control de las enfermedades y hacia la promoción de la salud de nuestra sociedad.
Tipos de modelos animales
La aplicación de procedimientos quirúrgicos, la administración controlada de fármacos y sustancias, la selección de mutaciones genéticas espontáneas y, más recientemente, las alteraciones genéticas dirigidas mediante procedimientos de recombinación han permitido disponer de un gran número de modelos para el estudio de las enfermedades cadiovasculares. Los sustratos anatómicos y fisiopatológicos pueden diferir según las especies animales utilizadas, y los diferentes modelos pueden presentar respuestas diversas ante las modificaciones inducidas experimentalmente11.
La elección adecuada del modelo experimental debe basarse fundamentalmente en la finalidad del estudio, es decir, hay que elegir aquel que mejor se adapte a los objetivos de la investigación, aunque en esta decisión influyen diversos factores, entre ellos las técnicas y los métodos necesarios para obtener la información, su disponibilidad y accesibilidad, las condiciones necesarias para la estabulación, el número de experimentos, el tipo de estudio, agudo o crónico, y en este caso, su duración.
Entre los modelos y las preparaciones utilizados en la investigación cardiovascular se encuentran los que se exponen a continuación.
Células aisladas y cultivos celulares
Existen distintas técnicas para aislar miocitos cardiacos de distintas especies animales. Los procedimientos utilizados consisten, básicamente, en aislar el corazón, perfundirlo con soluciones enzimáticas sin calcio para degradar la matriz de colágeno que interconecta los miocitos y extraer las células4,12. Una vez comprobada la viabilidad de las células, pueden aplicarse diversas técnicas de estudio, por ejemplo técnicas electrofisiológicas como las de patch-clamp,que permiten analizar las corrientes iónicas o los cambios de voltaje transmembrana (fig. 3).
Fig. 3. Esquema sobre la utilización de la técnica de patch-clamp en células aisladas con la membrana íntegra (parte superior), tras perforar la membrana (parte intermedia) o utilizando fragmentos de membrana celular (parte inferior).
El desarrollo de las técnicas implicadas en los cultivos celulares conjuntamente con las de la ingeniería genética ha ampliado las posibilidades de análisis de diversos fenómenos5,13-17. Así, mediante las técnicas de transfección, que consisten en la introducción de material genético (ADN recombinante) en el núcleo de diversas células de mamíferos, se ha hecho posible modificar su expresión proteínica y, con ello, sus funciones. Entre los estudios en que se utilizan estas técnicas, se encuentran los dirigidos a analizar el comportamiento de los canales iónicos implicados en la cinética del potencial de acción transmembrana tanto en condiciones basales como bajo la acción de diversos fármacos14-16.
En otros ámbitos, como el de la medicina regenerativa y el de la ingeniería tisular, se están desarrollando múltiples líneas de investigación encaminadas a conocer y controlar el proceso de diferenciación celular. Entre sus posibles aplicaciones están el desarrollo de estructuras tisulares de potencial aplicación clínica18.
Preparaciones en baño de órganos y tejidos
El estudio de determinadas estructuras de diversas especies animales, como músculos papilares, fibras de Purkinje, láminas de tejido miocárdico o vasos arteriales y venosos, aporta información en diversos campos que abarcan desde la mecánica cardiaca o vascular hasta la electrofisiología.
Las preparaciones de músculo papilar obtenidas a partir de animales de pequeño tamaño se basan en la extracción del músculo para situarlo en una cámara en la que fluye líquido nutricio a una temperatura constante y que permite que los extremos del músculo puedan fijarse a electrodos de estimulación y transductores de fuerza. En estas preparaciones se puede estudiar diversas propiedades mecánicas, como la relación fuerza-frecuencia, las respuestas a distintos tipos de sobrecarga y los mecanismos que las regulan, así como los efectos de diversas manipulaciones farmacológicas o no farmacológicas19,20.
La utilización de microelectrodos o electrodos extracelulares permite estudiar las propiedades electrofisiológicas de los miocitos y analizar los efectos de los fármacos21, por ejemplo, su capacidad de prolongar la repolarización a distintas frecuencias12. La utilización de estas técnicas en modelos modificados genéticamente amplía la capacidad de análisis de los procesos fisiopatológicos implicados en diversas enfermedades del ser humano.
También en baño de órganos pueden estudiarse láminas de miocardio, anillos vasculares o diversas preparaciones que incluyen al nodo sinusal, al nodo auriculoventricular o las fibras de Purkinje. La accesibilidad de los elementos que constituyen la preparación permite obtener información relevante sobre su comportamiento22-24. Uno de los inconvenientes de estas preparaciones de tejidos y órganos reside en la dificultad que pueda haber para la difusión adecuada del oxígeno, los solutos o los fármacos y las sustancias estudiados hasta sus capas más internas25,26. No hay esta dificultad en las preparaciones de miocitos aislados12. También puede obviarse utilizando procedimientos experimentales más complejos27, en los que se aísla la parte del corazón que se va a estudiar (p. ej., la aurícula derecha con el nodo sinusal o el músculo papilar unido al septo interventricular) y se irriga con sangre procedente del sistema arterial de otro animal (circulación cruzada) o con líquido nutricio, a través de las arterias coronarias que suplen la circulación a estos tejidos (p. ej., la arteria del nodo sinusal o la arteria septal anterior).
Sistema de langendorff (corazón aislado)
El método de Langendorff para estudiar corazones aislados fue descrito a finales del siglo xix. Permite el estudio de los fenómenos sin influencias neurohumorales y en condiciones controladas, accediendo directamente a las zonas de interés (fig. 4). La perfusión miocárdica se efectúa a través de las arterias coronarias que se rellenan retrógradamente. En la preparación clásica, el corazón se contrae sin realizar trabajo, aunque existen variantes (working heart) en las que, mediante diversos dispositivos, el corazón se contrae con una determinada carga (balón intraventricular relleno de líquido, perfusión desde la aurícula izquierda con conexión de la aorta a un sistema que regula la resistencia al flujo, etc.)2,28. La isquemia miocárdica puede producirse tras la ligadura de una arteria coronaria o reduciendo la oxigenación del líquido nutricio. Se utilizan corazones de distintas especies que abarcan desde la rata hasta animales grandes. Tras la extracción del corazón, se canula la aorta seccionada en su porción ascendente y por ella se suministra el líquido nutricio que, desde los senos de Valsalva y por las coronarias, irriga el miocardio y es drenado al exterior por el sistema venoso cardiaco. La presión de perfusión (entre 60 y 80 mmHg) o el flujo (entre 1,5 y 2,5 ml/g) se mantienen constantes y la oxigenación del líquido nutricio se efectúa con una mezcla de O2 (95%) y CO2 (5%). Este líquido contiene las proporciones adecuadas de electrolitos y glucosa (solución de Krebs-Henseleit, solución de Tyrode, etc.) y puede complementarse con albúmina o sangre, especialmente cuando se utilizan corazones de especies grandes. El pH se mantiene entre 7,35 y 7,4 y la temperatura, habitualmente, entre 36 y 37 °C.
Fig. 4. Esquema del sistema de Langendorff utilizado para el estudio de preparaciones de corazón aislado y perfundido de distintas especies animales.
En el corazón aislado y perfundido pueden emplearse electrodos múltiples extracelulares, tanto epicárdicos como endocárdicos o intramiocárdicos, para efectuar estudios cartográficos de la actividad eléctrica cardiaca y analizar las propiedades electro-fisiológicas básicas (refractariedad, conducción, automatismo), sus modificaciones mediante fármacos, agentes físicos, estímulos eléctricos u otros procedimientos, así como los mecanismos de inicio, perpetuación o cese de las arritmias cardiacas29-33 (figs. 5-8). Si el corazón aislado se encuentra sumergido en suero salino o en el propio líquido nutricio, puede registrase el equivalente a las derivaciones electrocardiográficas y analizar sus variaciones ante distintas maniobras o fármacos. La utilización de electrodos de succión o de presión permite obtener los llamados potenciales de acción monofásicos, que guardan relación con las características del potencial de acción transmembrana34. La utilización de sistemas ópticos basados en el registro de los cambios de luminiscencia de un marcador en función de las variaciones del potencial de membrana (fig. 9) ha hecho posible acercarse al estudio de las arritmias cardiacas disponiendo de información adicional sobre la duración del potencial de acción35-37.
Fig. 5. Diversos tipos de electrodos extra-celulares utilizados para el registro de los procesos de activación miocárdica en el corazón aislado y perfundido de conejo.
Fig. 6. Dispositivos utilizados para efectuar estudios cartográficos de la actividad eléctrica cardiaca introduciendo variaciones térmicas localizadas en el corazón aislado y perfundido de conejo.
Fig. 7. Parte superior: mapa de activación obtenido con un electrodo múltiple epicárdico, situado en la pared anterior del ventrículo izquierdo en una preparación de corazón aislado y perfundido de conejo durante la estimulación epicárdica. Parte inferior: identificación de la zona isquémica tras la oclusión coronaria mediante el análisis de las modificaciones de la repolarización ventricular.
Fig. 8. Análisis en el dominio de la frecuencia (análisis espectral y tiempo-frecuencia) de las señales registradas durante la fibrilación ventricular en la pared anterior ventricular izquierda. En la parte inferior izquierda se observan los mapas de isofrecuencias.
Fig. 9. Imágenes obtenidas con un sistema de cartografía óptica durante un episodio de fibrilación ventricular mediante el que se registran los cambios de luminiscencia de un marcador en función de las variaciones del potencial de membrana.
Mamíferos de pequeño tamaño
Entre las características que hay que tener presentes al elegir y utilizar modelos basados en animales pequeños, se encuentran las propias de cada especie; así, por ejemplo, en el cobaya la circulación colateral del árbol coronario está muy desarrollada y por eso la ligadura de una de las ramas principales no permite reproducir de manera estable situaciones de isquemia miocárdica. Entre otras ventajas relacionadas con la utilización de este tipo de animales, la alta tasa de reproducción (importante en la selección de casos con determinadas características genéticas en un tiempo adecuado) y la vida media corta permiten analizar la historia natural de la enfermedad en un tiempo breve. Por otra parte, la semejanza genética con el ser humano hace posible el estudio de determinadas alteraciones y su correspondencia con las enfermedades encontradas en la clínica, con lo que se amplía la información sobre los defectos implicados en las enfermedades hereditarias. No obstante, se ha de tener en cuenta las diferencias existentes en mecanismos básicos que limitan la extrapolación de resultados1-4.
En mamíferos pequeños existen varios tipos de modelos de alteraciones cardiovasculares que ocurren espontáneamente o son inducidos experimentalmente3. Las posibilidades de estudio se amplían al disponer de un número mayor mediante crianza selectiva. Los modelos de ratones basados en alteraciones genéticas espontáneas y el desarrollo de cepas con alteraciones poligénicas o de un único gen han facilitado el estudio de los mecanismos de diversos procesos fisiopatológicas y sus determinantes genéticos. Por otra parte, los avances tecnológicos han permitido originar, en animales como el ratón, modelos con alteraciones en sitios específicos del genoma. Estos procedimientos abarcan desde los no transgénicos, basados en la inducción de mutaciones y en el desarrollo de cepas obtenidas de diferentes tipos de embriones, hasta los originados por transferencia genética, que se iniciaron hace más de 25 años y han dado lugar a los procedimientos de provocación controlada de mutaciones con expresión de alteraciones relacionadas con el desarrollo de gran número de enfermedades3,5,7,38,39.
Los modelos transgénicos se basan en la introducción de ADN en el genoma de un determinado animal, hecho que ha sido posible tras el desarrollo tecnológico empleado en producir cultivos celulares, manipular embriones y recombinar el ADN. Entre las técnicas directamente relacionadas se encuentran la inyección pronuclear, la transgénesis viral y la recombinación homóloga. En el primer caso se efectúa una microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto y en el segundo caso se utilizan vectores virales en la introducción de genes para que se expresen o alteren el genoma. Las técnicas recombinantes se utilizan para introducir una alteración definida en un sitio específico del genoma. En estos casos la modificación genética se efectúa de manera dirigida modificando genes de modo específico. Así, en los denominados ratones knockout (inactivación genética mediante recombinación homóloga), se inactivan genes específicos para conseguir información sobre su función (permiten estudiar enfermedades originadas por mutaciones en las que hay pérdida total o parcial de formación de las proteínas mediante las que se expresa el gen)3. Por otra parte, en los denominados ratones knockin se reemplazan o se mutan determinados genes y se analizan sus patrones de expresión y los efectos de estas variaciones que conllevan cambios en una función3,39.
El procedimiento de formación de estos modelos se basa, en primer lugar, en la manipulación de células madre embrionarias. Éstas se obtienen de la masa de células internas de blastocistos machos tras la fertilización del huevo y, una vez cultivadas, se efectúan mutaciones específicas in vitro. Estas células son pluripotentes y son utilizadas para generar los ratones con las mutaciones elegidas. Las mutaciones se efectúan introduciendo en la célula embrionaria el material genético construido previamente. Para ello se utiliza el procedimiento de electroporación mediante choque eléctrico, tras el cual una pequeña proporción de las células sometidas al proceso incorporan las modificaciones diseñadas y construidas con anterioridad. Tras multiplicar las células embrionarias con la mutación (heterocigóticas), éstas son inyectadas en blastocistos almacenados previamente que después son implantados en ratones hembras seudopreñadas. Sus descendientes quiméricos, que en parte se derivan de las células embrionarias modificadas y en parte de los blastocistos donantes, son identificados y, tras el cruce de los heterocigotos, se obtienen los ratones mutantes homocigotos (fig. 10).
Fig. 10. Procedimientos de modificación genética mediante los que se inactivan, se reemplazan o se mutan genes específicos. Se basan en primer lugar en la manipulación de células madre embrionarias que se obtienen de blastocistos y en las que se efectúan mutaciones específicas introduciendo material genético construido previamente. Tras multiplicar las células embrionarias con la mutación (heterocigóticas), se las inyecta en blastocistos que después se implantan en ratones hembras. Tras el cruce de los descendientes quiméricos heterocigotos se obtienen los ratones mutantes homocigotos.
En modelos transgénicos de roedores se ha modificado el metabolismo lipídico aproximándolo al del ser humano para producir modelos de aterosclerosis40,41. También se han desarrollado modelos de insuficiencia cardiaca42-44, de diversos tipos de miocardiopatías7 o de arritmias determinadas genéticamente que permiten identificar las formas de expresión y analizar los genes relacionados2,5-6,38,39.
Así se estudian modelos de síndromes arrítmicos con características comunes a las encontradas en el ser humano. Por ejemplo, en relación con la fibrilación auricular, algunos de los modelos transgénicos se caracterizan por el desarrollo de fibrosis auricular o se trata de modelos knockout de la conexina 40, en los que hay alteraciones de la conducción. También se han creado modelos en los que se alteran las propiedades electrofisiológicas miocárdicas acortando la repolarización, tal como sucede en aquellos en que se sobreexpresa la proteína Kir2.1 alterando la corriente rectificadora de potasio IK16. En relación con la cardiopatía isquémica se han desarrollado diversos modelos, entre otros los utilizados para estudiar el precondicionamiento isquémico y su relación con la conexina 43 y las gap junctions45,46.
Mamíferos de mayor tamaño
Animales grandes se emplean en modelos en los que se considera relevante que estén presentes los mecanismos de regulación y homeostasis. Diversos aspectos pueden dificultar la interpretación de los resultados y hay que tenerlos presentes al plantear y diseñar los estudios2. Existen diferencias entre especies; por ejemplo, en las características de la circulación coronaria, que en el cerdo es terminal, sin anastomosis entre las ramas vasculares, mientras que en el modelo canino existen colaterales (fig. 11). Así, la ligadura coronaria en el cerdo se asemeja a la oclusión coronaria en sujetos sin circulación colateral, pero se aleja de la de los pacientes que la han desarrollado espontáneamente o en el contexto de la cardiopatía isquémica crónica. Por otra parte, también hay diferencias entre especies en la importancia relativa de las distintas ramas del árbol coronario, en función de la extensión del territorio que irrigan. En relación con el sistema de conducción cardiaco, la distribución de las fibras de Purkinje no es uniforme; en el cerdo es transmural, abarcando desde el endocardio hasta el epicardio2, mientras que en el perro o en el gato es predominantemente subendocárdica, por lo que se asemeja más a la del ser humano y por este motivo presentan una secuencia de activación ventricular más parecida. Existen diferencias entre el proceso de repolarización miocárdica de los modelos caninos y el de los seres humanos, diferencias que dificultan la comparación de los cambios ocurridos en el intervalo QT o en la onda T en distintas circunstancias. Otras diferencias entre especies son las derivadas de la expresión de los canales iónicos que regulan las características de los potenciales de acción de las células miocárdicas, ya que en algunas especies, como las ratas, no se expresan los canales IKr, pero sí que ocurre en conejos, cobayas y perros, y este hecho condiciona la posibilidad de análisis de algunos fenómenos como las arritmias relacionadas con la prolongación del intervalo QT.
Fig. 11. Características de la circulación colateral en distintas especies animales (modificado de: Maxwell MP, Hearse DJ, Yellon DM. Species variation in the coronary collateral circulation during regional myocardial ischaemia: a critical determinant of the rate of evolution and extent of myocardial infarction. Cardiovasc Res. 1987;21:737-46).
Otro de los aspectos que hay que considerar al utilizar estos modelos experimentales es la selección de la anestesia adecuada, ya que sus efectos pueden modificar los fenómenos estudiados2. El pentobarbital tiene efectos parasimpaticolíticos e influye en la distribución del flujo sanguíneo intramiocárdico, mientras que la combinación de morfina y alfacloralosa modifica en menor medida el control autonómico del sistema cardiovascular, aunque prolonga la repolarización ventricular. Los anestésicos de acción breve pueden ser de ayuda en los momentos iniciales de determinados protocolos en los que después se mantiene la anestesia con otros fármacos. El régimen de administración de los agentes anestésicos puede influir en la estabilidad del grado de sedación y hay que tener en cuenta algunos de sus efectos, como la depresión de la contractilidad o las modificaciones del tono autónomico (pentobarbital, propofol). Determinados anestésicos inhalatorios pueden modificar las propiedades electrofisiológicas de las células miocárdicas y tener efectos proarrítmicos (halotano, enflurano).
Los experimentos crónicos abarcan desde los basados en una intervención aguda tras la que se observan los efectos producidos por ella en presencia o ausencia de determinados fármacos (como las modificaciones en el grado de fibrosis miocárdica tras provocar una sobrecarga auricular por disfunción valvular) hasta aquellos que requieren la utilización de equipos especiales con los que se monitorizan las variables estudiadas mediante distintos procedimientos, como la telemetría o la transmisión por cable, y que, por lo tanto, requieren el implante de diversos sistemas (tabla 1).
Modelos animales en distintas áreas de investigación cardiovascular
Aterosclerosis
Se ha estudiado un amplio número de procesos relacionados con la aterosclerosis en modelos animales40. Se han utilizado conejos alimentados con dietas ricas en colesterol para analizar la formación y la evolución de las lesiones, así como su regresión al modificar la dieta47 o al añadir tratamientos específicos48-51, hechos también comprobados en otras especies animales52-56. En roedores, la aplicación de técnicas transgénicas ha permitido crear modelos con alteraciones del metabolismo lipídico presentes en el ser humano57, por ejemplo, mediante la manipulación de la expresión de la apoproteína E58. En estos ratones la transferencia genética con vectores que contienen apoA-IcDNA para aumentar la concentración del colesterol de las lipoproteínas de alta densidad (cHDL) ha dado lugar a la remisión de las lesiones59, que también se ha conseguido aumentando de manera prolongada la expresión de apolipoproteína E mediante vectores virales60,61. El trasplante de segmentos de aorta que contienen lesiones ateroscleróticas desde modelos de ratones transgénicos con niveles altos de apolipoproteína B, bajas concentraciones de cHDL y alimentación con dietas hiperlipídicas a receptores normales permite el estudio de los procesos implicados en la estabilización y remisión de las placas62,63. Fenómenos como el de la trombogénesis y la función plaquetaria también se analizan en modelos animales64, en los que la utilización de cámaras de perfusión especialmente diseñadas65 permite analizar los mecanismos implicados en la trombosis mural.
Isquemia-reperfusión e infarto de miocardio
Diversas líneas de investigación en modelos animales se han dirigido a analizar la posibilidad de limitar el tamaño del infarto. Hace algunas décadas se plantearon estudios sobre fármacos y sustancias que pudieran enlentecer o evitar el desarrollo de la necrosis66,67, con resultados limitados y no reproducibles46. Sin embargo, los modelos experimentales de oclusión coronaria proporcionaron datos precisos sobre el desarrollo de la necrosis68-73. Tras reconocerse el papel relevante de la reperfusión para salvar miocardio isquémico, se comenzó a analizar también su participación en el desarrollo de la lesión. En modelos animales se han identificado mecanismos patológicos asociados a la sobrecarga de calcio, la acción de los radicales de oxígeno libres y la acción de células inflamatorias con implicación de leucocitos, moléculas de adhesión y citocinas, entre otros factores74. También se ha analizado el daño mitocondrial75 identificando alteraciones de la membrana (formación de poros) que la hacen permeable a diversas sustancias y iones y determinan la muerte celular. La inhibición de la apertura de estos poros podría asociarse a la cardioprotección durante la isquemia-reperfusión.
Otro de los temas en el que se ha avanzado es el del precondicionamiento y el poscondicionamiento isquémico76,77. Existen protocolos experimentales con intervenciones que limitan el tamaño del infarto de manera reproducible debido al precondicionamiento; por ejemplo, en modelos caninos, efectuando varios periodos de oclusión de la arteria coronaria descendente anterior de 5 min, separados por lapsos similares en los que se restablece la perfusión y tras los cuales se efectúa una oclusión duradera. El poscondicionamiento también reduce el tamaño del infarto; por ejemplo, efectuando varios periodos intermitentes de oclusión coronaria de corta duración (30 s) al principio de la reperfusión tras una oclusión duradera. Ambos fenómenos han sido estudiados en distintas especies animales y se ha analizado la evolución temporal del efecto protector y los mecanismos moleculares implicados, que siguen siendo objeto de investigación46,78-84.
Miocardiopatías
La miocardiopatía dilatada, que se caracteriza por la dilatación ventricular y el deterioro de la función sistólica, es la más frecuente y una de las causas importantes de insuficiencia cardiaca. Entre los estudios dirigidos a analizar su etiopatogenia, se encuentran los centrados en las formas familiares, relacionadas con mecanismos genéticos que dan lugar a diversas alteraciones, como en la actina alfa cardiaca, la cadena pesada de la betamiosina o la troponina T.
Se han desarrollado modelos en animales pequeños como ratas, ratones y hámsters para el estudio de la patogenia7,42,85,86. En cepas de hámster con miocardiopatía dilatada espontánea (BIO14.6, CHF 147) se ha descrito un desarrollo progresivo de miolisis, hipertrofia, dilatación e insuficiencia cardiaca congestiva, con cambios en la expresión enzimática que conducen a un aumento del estrés oxidativo (cepa TO-2). En modelos modificados genéticamente42,86 se han inducido miocardiopatías dilatadas que incluyen mutaciones en los genes que regulan el citoesqueleto (ausencia de genes para distrofina y utrofina) y desarrollan distrofias musculares y miocardiopatías. También se han originado modelos knockout de la proteína LIM muscular que desarrollan miocardiopatías dilatadas. La sobreexpresión de proteínas G da lugar a miocardiopatías en las que intervienen los mecanismos de apoptosis. Existen mutaciones mitocondriales con déficit en la fosforilación oxidativa que cursan con miocardiopatías dilatadas. En modelos con animales grandes, más cercanos a la clínica, se analizan aspectos relacionados con la mecánica, las alteraciones moleculares y metabólicas y las adaptaciones neurohumorales inadecuadas.
Insuficiencia cardiaca
En el terreno de la insuficiencia cardiaca, el análisis de sus causas y la traslación de los conocimientos existentes desde los estudios experimentales a la práctica clínica, tanto en el terreno de la protección miocárdica como en el del remodelado ventricular, son otro de los retos que tiene ante sí el investigador que estudia las enfermedades cardiovasculares.
En el desarrollo de la insuficiencia cardiaca intervienen tanto el corazón como la circulación periférica y los complejos mecanismos neurohumorales que regulan los procesos hemodinámicos. Existen cepas de animales pequeños en los que la insuficiencia cardiaca ha aparecido debido a alteraciones genéticas espontáneas. También se utilizan animales en los que se han efectuado modificaciones genéticas artificialmente43,44,86. Entre los modelos murinos en los que se aplica la tecnología transgénica y de knockout43,44, se encuentran los que se caracterizan por alteraciones en el manejo del calcio y el desarrollo de hipertrofia42,86. En ellos se estudia la relación entre la expresión de la Ca2+ATPasa del retículo sarcoplásmico (SERCA) y el desarrollo de insuficiencia cardiaca tras alterar su expresión.
En animales de mayor tamaño existen diversos procedimientos para producir modelos de insuficiencia cardiaca, entre ellos la estimulación auricular o ventricular a una frecuencia rápida (frecuencia 3-4 veces superior a la espontánea sinusal)87, que en un plazo de 3-5 semanas origina insuficiencia cardiaca con reducción de la función sistólica, disminución del gasto cardiaco, aumento de las resistencias vasculares sistémicas, aumento del estrés sistólico de la pared ventricular y alteraciones electrofisiológicas y metabólicas. También se emplean diversos tipos de sobrecarga de presión y de volumen o de isquemia miocárdica; por ejemplo, mediante la provocación de insuficiencias valvulares que dan lugar a sobrecargas de volumen o aumentando la impedancia a la eyección ventricular, que origina sobrecarga de presión. En estos modelos, además de analizar los factores determinantes del deterioro de la función ventricular, se analizan las respuestas a diversos tratamientos y se ponen a prueba diversas técnicas de asistencia circulatoria.
Arritmias
Es difícil encontrar modelos de arritmias que reúnan todos los factores determinantes anatomopatológicos, electrofisiológicos, bioquímicos y moleculares que están presentes en la clínica. En modelos transgénicos se estudian los mecanismos implicados en la génesis de diversos tipos de arritmias cardiacas en el contexto de las canalopatías y diversos tipos de miocardiopatías5,38,39. En relación con la fibrilación auricular, los modelos animales han aportado información relevante sobre sus mecanismos y sobre diversos procedimientos terapéuticos6. Existen diversos modelos de fibrilación auricular en diferentes contextos cuya información es complementaria: estimulación vagal o perfusión continua de acetilcolina, sobrestimulación persistente, insuficiencia cardiaca congestiva, pericarditis estéril, isquemia auricular, insuficiencia mitral, sobrecarga de volumen, insuficiencia respiratoria, acciones de fármacos (cesio para inducir la formación de pospotenciales y automatismos anormales, aconitina para crear focos ectópicos) y modelos transgénicos, entre otros6.
En el contexto de la isquemia miocárdica y de la reperfusión, se generan diversos tipos de arritmias46,88,89. Su análisis ha aportado información relevante en relación con la muerte súbita, por ejemplo. Uno de los modelos animales más utilizados para estudiar estos fenómenos es el de Harris en dos etapas, en el que, tras ligadura de la arteria coronaria descendente anterior situando una aguja hipodérmica paralela a la arteria, ésta es retirada inmediatamente para evitar su oclusión completa, pero produciendo una estenosis y la consiguiente reducción del flujo; 30 min después se ocluye completamente la arteria mediante una segunda ligadura2,90,91. Mediante este procedimiento, o los que se han derivado de él utilizando ligaduras con un grado de obstrucción controlado mediante el análisis del flujo distal, se evita el desarrollo inmediato de fibrilación ventricular gracias al precondicionamiento isquémico92 y con ello se puede estudiar diversos fenómenos producidos por la isquemia miocárdica, tanto mecánicos como eléctricos. En estos modelos se ha determinado el papel relevante del automatismo anormal de las fibras de Purkinje, parcialmente despolarizadas, en el inicio de arritmias sostenidas durante las primeras horas tras la oclusión coronaria89. También se ha observado que la actividad desencadenada por pospotenciales es un fenómeno más tardío.
Para aproximarse a los acontecimientos que ocurren en la cardiopatía isquémica crónica se han desarrollado diversos modelos93. La simultaneidad de isquemia y ejercicio físico puede ayudar a comprender los mecanismos implicados en la aparición de arritmias en estas situaciones, tanto sin infarto previo como tras él, así como los factores que determinan o facilitan su aparición o los posibles efectos beneficiosos de actuaciones terapéuticas, como las encaminadas a evitar la fibrilación ventricular y la muerte súbita. La actividad vegetativa desencadenada por los reflejos iniciados por la isquemia, por los cambios hemodinámicos producidos por ella o por el ejercicio efectuado simultáneamente ha sido estudiada desde diversos puntos de vista, incluido el análisis de la intensidad de la respuesta de los barorreceptores, que determina la probabilidad de que se produzca fibrilación ventricular93,94.
La inducibilidad de determinadas arritmias también puede ser estudiada mediante procedimientos de estimulación programada. Otros métodos de inducción de arritmias2 se basan en la utilización de fármacos o sustancias que facilitan la producción de pospotenciales (catecolaminas, digitálicos)95 o generan actividad repetitiva (focos ectópicos, aconitina) o simulan o favorecen la producción de arritmias asociadas al alargamiento del intervalo QT (taquicardias ventriculares en torsades de pointes) (fármacos antiarrítmicos con efecto inverso dependiente de la frecuencia o de otro tipo). El clofilium, que disminuye la conductancia de los canales HERG, o la metoxamina pueden producir en conejos in vivo taquicardias de puntas retorcidas. La veratridina en corazones de cobaya aislados y perfundidos2 o la bradicardia por bloqueo auriculoventricular completo en animales de mayor tamaño, que da lugar a dilatación e hipertrofia ventricular, son otros modelos utilizados para inducir taquicardias polimórficas. En estos modelos se han analizado parámetros predictores de arritmias como los relacionados con la variabilidad del QT y también la proarritmogenicidad de determinados fármacos antes de introducirlos en la clínica2.
El concepto de remodelado eléctrico y estructural en la fibrilación auricular ha partido de estudios experimentales96-98 y ha conducido a replantear acciones terapéuticas. En esta arritmia se han estudiado los cambios en la refractariedad, en la velocidad de conducción y en la longitud de onda del proceso de activación asociados al tiempo de desarrollo de la arritmia99, así como los mecanismos iónicos implicados, y los cambios asociados al remodelado estructural caracterizado por el desarrollo de fibrosis y alteraciones de la conducción. Diversas aproximaciones terapéuticas encaminadas al control de la fibrilación auricular se han beneficiado de la información obtenida en modelos animales, tanto sobre los mecanismos causales como sobre las respuestas a intervenciones farmacológicas, quirúgicas o basadas en procedimientos de ablación con radiofrecuencia100-106. Se ha comprobado que determinados fármacos detienen la arritmia sin modificar la longitud de onda del proceso de activación miocárdico107.
El control de la muerte súbita por arritmias ventriculares sigue siendo un problema no resuelto y un reto para los investigadores que trabajan en disciplinas diversas. Los resultados clínicos de los desfibriladores automáticos implantables han supuesto un avance en este terreno y en su desarrollo han contribuido los estudios experimentales108.
Futuras direcciones
Los avances en el control de las enfermedades cardiovasculares se apoyan en el mejor conocimiento de aspectos muy diversos, que abarcan desde los abordados en estudios epidemiológicos, ensayos clínicos y registros hasta los estudiados en los trabajos de investigación básica. En este terreno se ha progresado en el análisis molecular: los determinantes genéticos de gran número de procesos, sus interacciones, los mecanismos de transcripción o las vías de señalización, información que ha de proporcionar nuevas claves en el conocimiento del desarrollo y las funciones de órganos y sistemas.
La utilización de técnicas clásicas como las del sistema de Langendorff, con variantes en las que el corazón se somete a cargas controladas, conjuntamente con los procedimientos de modificación genética, ha ampliado las posibilidades de estudio de la mecánica cardiaca y de los procesos de contracción y relajación, lo que permite el análisis de los efectos funcionales de alteraciones en la expresión de proteínas relacionadas con el retículo sarcoplásmico, el manejo intracelular del calcio o los elementos contráctiles del músculo cardiaco109. Las determinaciones in vivo efectuadas en modelos murinos con alteraciones genéticas que producen hipertrofia aportan información sobre los factores que determinan la función sistólica y la diastólica y sobre las intervenciones farmacológicas que las modifican. La utilización de estos modelos requiere la adaptación de los sistemas de registro a las características de los animales transgénicos de pequeño tamaño.
La introducción de técnicas no invasivas como la ecocardiografía, con transductores y capacidad de resolución adecuados (frecuencias de emisión altas y mejor resolución temporal para adecuarla a la frecuencia cardiaca elevada de estos animales), ha permitido ampliar la información sobre la anatomía y la función cardiaca y estudiar las consecuencias de sobrecargas de presión y de volumen en modelos transgénicos, para analizar los factores relacionados con el desarrollo de hipertrofia o dilatación ventricular. La combinación de catéteres intracavitarios y técnicas ultrasónicas añade el análisis de las curvas presión-volumen.
En los estudios experimentales se ha introducido más recientemente la resonancia magnética cardiaca para obtener información anatómica y funcional, que se ha añadido a las técnicas ultrasónicas en cuanto a la posibilidad de aplicarla in vivo. También aporta información sobre la perfusión y el metabolismo miocárdicos, la existencia de necrosis miocárdica o sobre el manejo del ión calcio durante los procesos de excitación-contracción110.
Se están desarrollando herramientas para el estudio de la función mecánica intramiocárdica y de los fenómenos de torsión. El análisis metabólico incluye métodos espectroscópicos para detectar el P31 o el H1, estableciendo cocientes como el de la fosfocreatinina y el ATP, relacionado con la producción de energía. También permite el análisis de los mecanismos básicos que influyen en la función cardiaca o en los procesos de remodelado ventricular y de formación de la cicatriz postinfarto. El estudio de nuevos agentes que permiten contrastar el miocardio de manera dirigida abre paso a la evaluación de diversos fenómenos como la apoptosis de las células miocárdicas.
La tomografía de emisión de positrones está siendo utilizada en modelos experimentales para el análisis y la cuantificación del recambio de glucosa en el miocardio o para detectar defectos regionales de la perfusión y, junto con la tomografía computarizada de emisión monofotónica (SPECT), aporta información molecular mediante la utilización de marcadores que se unen a dianas específicas.
En el terreno de la electrofisiología cardiaca, el perfeccionamiento de los sistemas ópticos hasta conseguir resoluciones temporales comparables a las obtenidas con electrodos extracelulares amplía las posibilidades de estudio de las arritmias cardiacas. También supone un avance el desarrollo de matrices de microelectrodos capaces de estimulación y registro de las señales bioeléctricas con una gran resolución temporal y espacial, que permite estudiar con precisión las interacciones y conexiones entre diferentes tipos de células y tejidos, así como determinar los efectos de los fármacos en las características del potencial de acción111.
Este trabajo ha sido realizado en parte con las ayudas a la investigación del Ministerio de Sanidad PI06/0758 (Proyecto FIS) y RD06/0003/0010 (RETIC: REDINSCOR).
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Correspondencia: Dr. F.J. Chorro.
Servicio de Cardiología. Hospital Clínico Universitario. Avda. Blasco Ibañez, 17. 46010 Valencia. España.
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