Métodos: Se ha realizado un diseño ecológico, en el que las unidades de estudio y análisis son cuatro provincias españolas con amplia variación en la mortalidad cardiovascular en la edad adulta. El diseño compara la dieta, variables antropométricas y marcadores biológicos, fundamentalmente lípidos y antioxidantes plasmáticos, entre los niños de 6-7 años de las dos provincias de mayor mortalidad y niños de las dos provincias de menor mortalidad. La información para cada provincia se recoge de forma transversal en muestras representativas de los niños de cada provincia. Discusión. Las evidencias recogidas en la bibliografía, referentes a países del norte de Europa, sugieren la contribución de factores ambientales en etapas tempranas de la vida a la aparición de la enfermedad cardiovascular en la edad adulta. El estudio Cuatro Provincias proporcionará, por primera vez, información sobre la influencia de factores de la vida temprana sobre el riesgo cardiovascular en un país del área mediterránea. También aportará datos sobre la alimentación en la edad escolar en cuatro provincias y permitirá estimar valores poblacionales de las variables de interés en dichas provincias.
INTRODUCCIÓN
Este trabajo describe los principales objetivos y el diseño del estudio Cuatro Provincias (4P), que mide la dieta, el perfil lipídico y algunos antioxidantes plasmáticos, en niños de 6-7 años de cuatro provincias españolas con una amplia variación en la mortalidad por cardiopatía isquémica. Junto al estudio IBERICA 1 , el estudio 4P probablemente representa una de las principales iniciativas para identificar los determinantes de la importante variación geográfica en la cardiopatía isquémica en España. También es un ejemplo de colaboración interdisciplinaria, en la que participan profesionales de la clínica, la epidemiología, la nutrición, la bioquímica y la biología molecular. Por último, sus hipótesis no han sido contrastadas en nuestro país y son relevantes para la prevención cardiovascular, en especial la coronaria, en España.
España tiene una importante variación geográfica en la mortalidad por cardiopatía isquémica (CI) y por enfermedad cerebrovascular (ECV). La mortalidad por estas enfermedades en las provincias de mayor mortalidad es aproximadamente el doble que la de las provincias de menor mortalidad 2,3 , lo que representa un importante potencial de prevención, si se identifican los determinantes de dicha variación.
España también presenta una aparente paradoja, desde la perspectiva de la clásica hipótesis dieta-corazón 4 , en la distribución geográfica de la mortalidad por CI y ECV. Las regiones del norte y oeste peninsular, que son las que tienen mayor consumo de grasa total y grasa saturada, presentan la menor mortalidad por CI y ECV 2,3 . La menor mortalidad cardiovascular de estas regiones puede explicarse en un 30% por su mayor consumo de vino, pescado y frutas, su mayor actividad física y el nivel socioeconómico más elevado 5-8 . Sin embargo, los factores clásicos de riesgo cardiovascular, como el tabaco, la hipertensión arterial y la hipercolesterolemia no parecen explicar la mayor parte de las diferencias geográficas de la mortalidad cardiovascular en España 5-8 , dentro de otros países 9-11 o entre países 12-14 .
Por tanto, se desconocen todavía la mayoría de los factores responsables de las importantes variaciones en la mortalidad cardiovascular dentro de España. El estudio 4P tiene como principal objetivo examinar en qué medida factores ambientales que actúan en etapas tempranas de la vida, y en concreto durante la infancia, pueden contribuir a explicar dichas diferencias. Entre los factores ambientales, son motivo de interés la dieta, el perfil lipídico y los antioxidantes plasmáticos.
MÉTODOS
Diseño
Es un diseño ecológico, en el que las unidades de estudio y análisis son cuatro provincias españolas con amplia variación en la mortalidad cardiovascular en la edad adulta. El diseño compara la dieta, variables antropométricas y marcadores biológicos (fundamentalmente lípidos y antioxidantes en muestras sanguíneas) entre los niños de las dos provincias de mayor mortalidad y los niños de las dos provincias de menor mortalidad.
La información se recoge de forma transversal en muestras representativas de los niños de cada provincia. Esto permite, además, estimar valores poblacionales de las variables de interés, y estudiar la relación entre ellas en las poblaciones de las que se seleccionan las muestras.
La principal limitación de un estudio ecológico con sólo 4 puntos es la ausencia de un rango continuo de variación de las características de interés, y la dificultad para extrapolar los resultados a las provincias no estudiadas.
Sujetos de estudio
Son niños de 6-7 años representativos de la población de dicha edad de las provincias de Cádiz, Madrid, Orense y Las Palmas. Se han elegido estas provincias porque entre ellas existe una variación de aproximadamente dos veces en la mortalidad coronaria (tabla 1), y por razones logísticas.
La selección de los niños se realiza mediante muestreo aleatorio, estratificado por sexo y nivel socioeconómico (titularidad pública o privada de los colegios), y por conglomerados de los centros escolares de las provincias. El muestreo tiene dos etapas. En la primera, se seleccionan los centros escolares a partir de los listados disponibles en las delegaciones territoriales de las Consejerías de Educación. En la segunda etapa, se seleccionan las aulas y los alumnos. Se excluyen los niños que, según comunicado de los padres, padecen enfermedades cardiovasculares o nefrológicas, por la posible alteración de los valores de las variables de interés. En cada provincia se seleccionan 6 escuelas, y en cada escuela se invita a participar a 70 niños. Esto hace que el conjunto de la muestra esté formado aproximadamente por 1.600 niños, lo que permite un poder superior al 90% en el contraste estadístico (p < 0,05) de la mayoría de las hipótesis de estudio. Aun cuando numerosas hipótesis son difíciles de cuantificar, el tamaño muestral del estudio se ha calculado asumiendo, de forma conservadora, diferencias absolutas entre los grupos del 5% y prevalencias del 20% en el grupo basal 15 .
Recogida de información
Se realizan presentaciones orales del estudio ante los miembros del Consejo Escolar de cada centro. Posteriormente se remite a los padres de los niños invitados a participar en el estudio una carta con información sobre los objetivos y procedimientos del mismo, y se obtiene la autorización escrita de los padres. Se pide también a éstos que, en la medida de lo posible, soliciten el consentimiento de cada niño.
En cada provincia la información es recogida por un equipo de campo formado por un médico y varias enfermeras, que realizan las medidas físicas y la extracción de sangre, y por un grupo de personas entrenadas en la realización del cuestionario de frecuencia de consumo de alimentos, que realiza dicha encuesta alimentaria a las madres de los niños.
A todos los niños estudiados se les remite, en el plazo de 3-4 semanas desde la recogida de datos, un informe con su perfil lipídico.
Medidas físicas
Las medidas se realizan sobre los niños vestidos con ropa ligera y sin zapatos. La talla se mide hasta el último milímetro con un estadiómetro portátil. El peso se mide hasta el último 0,1 kg con una balanza electrónica digital homologada. A partir de estas medidas se calcula el índice ponderal (peso en kg/talla 2 en m) 16 .
Información alimentaria y nutricional
Se obtiene a través de un cuestionario de frecuencia de consumo alimentario, inicialmente desarrollado en adultos y validado previamente 17 . Este cuestionario constituye un método directo de estimación de la ingesta alimentaria individual a partir de un formato estructurado. Así, la persona encuestada responde el número de veces que, como promedio, ha ingerido un alimento determinado durante un período de tiempo en el pasado. Es un cuestionario articulado en tres ejes: una lista de alimentos, unas frecuencias de consumo en unidades de tiempo y una porción o ración estándar establecida como punto de referencia para cada alimento 18 . Para este estudio, el cuestionario se ha adaptado a la población escolar mediante la modificación de la lista de alimentos y las porciones consumidas. Estas modificaciones están basadas en una amplia revisión de la bibliografía sobre encuestas poblacionales de alimentación infantil en España 19 . Asimismo, se han modificado los programas informáticos de conversión de alimentos a nutrientes del cuestionario original en adultos, para adaptarlos a las características del nuevo cuestionario infantil. A partir de la información de referencia para la conversión de alimentos en nutrientes contenida en las tablas desarrolladas para la población española 20,21 , se ha diseñado un programa &laqno;ad hoc» de conversión de la frecuencia de consumo de alimentos, que proporciona una base con la frecuencia anual de alimentos consumidos y la frecuencia diaria del consumo de los nutrientes estudiados en cada uno de los individuos a los que se pasa el cuestionario. Ello permite la estimación de nutrientes y de la ingesta calórica total, necesarios para la correcta interpretación del efecto de los nutrientes bajo consideración 22 .
Muestras de sangre
Las muestras de sangre se obtienen por venopunción después de las medidas físicas, en ayunas de una noche, y después de aplicar una crema anestésica sobre la piel. Se obtienen 10 ml de sangre en tubo Vacutainer conteniendo EDTA, como antioxidante y anticoagulante. Las muestras se mantienen en hielo y se remiten para análisis a un laboratorio central. Se ofrece un desayuno a todos los niños después de la extracción de sangre.
Determinaciones analíticas
Las muestras se centrifugan, se separan sus fracciones y se congelan a 70 °C. En el plasma obtenido se valoran por métodos enzimáticos colesterol, triglicéridos, y fosfolípidos, tanto en plasma total como en las HDL totales, y por métodos inmunoquímicos apolipoproteína A y apolipoproteína B. Asimismo, se cuantifican antioxidantes hidro y liposolubles por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). En concreto, se determinan retinol, alfa-tocoferol, beta-tocoferol, alfa-caroteno, beta-caroteno, licopeno 23 y ácido ascórbico 24 . Por último, se determinan otros antioxidantes, como bilirrubina, albúmina y ácido úrico por métodos automatizados, y la capacidad antioxidante total del plasma 25 .
Plan de trabajo
En enero de 1999 se ha completado la recogida de información en las provincias de Madrid, Orense y Cádiz. En la primavera de 1999 se recogerá información en Las Palmas. Inmediatamente después de cada recogida de información se realizan las determinaciones analíticas y la explotación de los cuestionarios de frecuencia de consumo de alimentos. Se espera que los primeros resultados puedan hacerse públicos a finales de 1999.
Aspectos éticos
El protocolo de estudio ha obtenido el informe favorable del Comité Ético de Investigación Clínica de la Fundación Jiménez Díaz, en Madrid. El conjunto de
la investigación cumple las salvaguardias éticas de la Declaración de Helsinki y sus actualizaciones posteriores, y la legislación española sobre investigación clínica en humanos 26 .
DISCUSIÓN
Factores ambientales en la vida temprana y enfermedad cardiovascular
Barker y Osmond han descrito que las regiones inglesas con mayor mortalidad por CI presentaban mayor mortalidad infantil y materna 60 años antes 27-29 . Existe también una relación del bajo peso y talla en el nacimiento, y del menor desarrollo infantil, con la presencia de factores de riesgo clásicos de la enfermedad cardiovascular en la edad adulta, como las concentraciones plasmáticas de colesterol, apolipoproteína B 30,31 y fibrinógeno 32 , la presión arterial 33,34 , la distribución de la grasa corporal (obesidad central) 35 y la intolerancia a la glucosa y la diabetes 33 . Además, recientemente se ha observado que los niños de 5 a 7 años de las 10 ciudades inglesas con mayor mortalidad por CI tienen mayor peso, índice ponderal (peso/talla 2 ) y presión arterial que los niños de las 10 ciudades con menor mortalidad coronaria 36 .
A pesar de que no es posible descartar el efecto de las condiciones ambientales adversas a lo largo de toda la vida sobre la mortalidad por CI y ECV 37,38 , de que en algunos estudios las relaciones observadas son poco específicas y afectan a enfermedades no cardiovasculares 37,38 , y de que la bibliografía es contradictoria sobre el período concreto de la vida temprana (el período fetal, el primer año de vida, la primera infancia, la adolescencia o todos ellos) en el que la influencia de los factores ambientales es más importante 39 , el conjunto de las evidencias descritas sugiere la contribución de factores ambientales en etapas tempranas de la vida a la aparición de la enfermedad cardiovascular. El conjunto de dichas evidencias condujo a Barker y su grupo a sugerir la hipótesis de la &laqno;programación» de la cardiopatía isquémica y de la enfermedad cerebrovascular, isquémica y hemorrágica, por la que estas enfermedades serían el resultado en la edad adulta de la acción de factores medioambientales que actuarían intraútero 40,41 y en la infancia temprana 42 .
El mecanismo patogénico de dicha &laqno;programación» serían deficiencias nutricionales en períodos tempranos de la vida que inducirían adaptaciones metabólicas para aprovechar mejor los nutrientes escasos. Estas adaptaciones se mantendrían a lo largo de la vida, y aumentarían la susceptibilidad a la enfermedad cardiovascular derivada de las condiciones de mayor afluencia en la edad adulta, como el exceso de ingesta calórica, de hidratos de carbono y de grasas 40-42 . Se ha postulado que éste es el mecanismo que subyace en la epidemia de enfermedad cardiovascular del siglo xx en los países desarrollados, que culminó en la década
de los sesenta, y se siguió de un período de descenso de la mortalidad cardiovascular en el que todavía nos encontramos 43 . La epidemia cardiovascular se &laqno;incubó» en las últimas décadas del siglo pasado y en las primeras del presente, en las que las condiciones de vida, y en especial la nutrición, eran deficientes para amplios sectores de la población. La epidemia se manifestó con fuerza en la posguerra de la Segunda Guerra Mundial, al mejorar sustancialmente las condiciones de vida. El descenso de la mortalidad que se inicia en los años setenta probablemente refleja las mejores condiciones de vida de la infancia temprana en las generaciones de la posguerra. Un mecanismo similar podría explicar el cambio en la relación de la clase social con la enfermedad cardiovascular, especialmente la cardiopatía isquémica, en las últimas décadas. Hasta los años setenta la cardiopatía isquémica era más frecuente en las clases sociales más favorecidas. A partir de entonces afecta más a las clases sociales más bajas 44 .
El estudio 4P proporcionará, por primera vez según nuestro conocimiento, información sobre la importancia de factores de la vida temprana sobre el riesgo cardiovascular en países diferentes a los nórdicos y el Reino Unido, de donde proceden la gran mayoría de los datos sobre la &laqno;programación» de la enfermedad cardiovascular. En concreto, informará sobre la existencia de este fenómeno en un país mediterráneo, de bajo riesgo cardiovascular, que no ha experimentado una epidemia cardiovascular en las últimas décadas, y en el que el bajo riesgo cardiovascular parece estar ligado a factores dietéticos y otros hábitos de vida tradicionales.
Antioxidantes naturales y variaciones geográficas en la enfermedad cardiovascular
La oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) aumenta la formación de células espumosas, un componente característico de las estrías grasas, el primer estadio en el desarrollo de la arteriosclerosis. Asimismo, las LDL oxidadas son citotóxicas para las células endoteliales en cultivo, aumentan la adhesión de los monocitos al endotelio y su migración al subendotelio, entre otras propiedades proaterogénicas 45,46 . Todo ello motivó la hipótesis de que la modificación oxidativa de las LDL es un componente importante en el desarrollo de la arteriosclerosis, y que los antioxidantes naturales podrían constituir una defensa frente a la misma.
En modelos animales experimentales, en concreto animales deficientes en el receptor de la LDL o sometidos a dietas con grandes cantidades de colesterol, el probucol y la vitamina E, potentes antioxidantes, han retrasado el desarrollo de estrías grasas 47,49 . Además, varios estudios de casos y controles, y estudios prospectivos de cohortes, han proporcionado evidencias, en algunos casos inconsistentes, sobre el posible efecto protector del beta-caroteno, el alfa-tocoferol y la vitamina C, reduciendo el riesgo de infarto de miocardio. Sin embargo, los ensayos clínicos realizados posteriormente, como el Physicians Health Study en los EE.UU. o el ensayo Alpha-Tocopherol Beta-Carotene Cancer Prevention Trial (ATBC) en Finlandia, no han podido establecer si existe este efecto 50,51 . Es posible que los ensayos en marcha, como el Supplémentation en Vitamines et Miréraux Antioxidants (SUVIMAX), el Women's Health Study, o el B-Carotene and Retinol Efficacy Trial (CARET), puedan contribuir a establecer de forma más clara el posible papel de los antioxidantes naturales en la prevención de la enfermedad cardiovascular.
Los antecedentes más directamente relacionados con el estudio 4P son los trabajos que han explorado la capacidad de los antioxidantes naturales para explicar las diferencias geográficas en las enfermedades cardiovasculares. En la tabla 2 se resumen los principales estudios de este tipo, en los que se midieron el consumo de alimentos, en especial frutas y verduras, y la presencia de antioxidantes en muestras de sangre. Dichos estudios refieren, en general, una correlación negativa de las frutas y verduras con la mortalidad cardiovascular a través de las poblaciones y a lo largo del tiempo. Entre los estudios que midieron los antioxidantes plasmáticos destaca el proyecto MONICA 60 . En una muestra aleatoria de 100 sujetos de cada uno de 16 países, se observó una correlación negativa entre las concentraciones plasmáticas de alfa-tocoferol y la mortalidad coronaria. Sin embargo, las correlaciones para la vitamina C y el caroteno no alcanzaron la significación estadística 60 . Por último, también destaca el trabajo de Riemersma et al, quienes observaron que las concentraciones de vitamina E son más bajas en regiones de países con alta mortalidad coronaria, como Finlandia y Escocia, que en regiones de países con menor mortalidad, como Italia 61 .
Todo lo anterior hace que la relación entre los antioxidantes naturales y la enfermedad coronaria sea una hipótesis muy atractiva, pero todavía insuficientemente contrastada. Por esta razón, el estudio 4P examinará, por primera vez en España, la relación entre algunos antioxidantes en la dieta y en muestras sanguíneas de niños de 6-7 años, con la mortalidad cardiovascular en la vida adulta en un ámbito provincial. Como pasos previos, proporcionará información actualizada y de base poblacional sobre la ingesta de antioxidantes y sus concentraciones plasmáticas, en niños de 6 y 7 años. Dicha información podrá compararse con la relativamente exigua disponible hasta ahora en España 19 . Por último, permitirá estudiar la relación comunitaria de la ingesta de alimentos y antioxidantes con los valores plasmáticos de estos últimos.
Lípidos y variaciones geográficas en la enfermedad cardiovascular
Son muy numerosas las evidencias sobre la relación positiva entre el colesterol sérico y la aparición de enfermedad coronaria, en poblaciones 63 y en individuos 64,65 . Por esta razón, la colesterolemia es considerada un factor mayor de riesgo cardiovascular. También es conocido, por estudios metabólicos, el efecto de los diferentes tipos de ácidos grasos y del colesterol de la dieta sobre la colesterolemia y algunas fracciones lipídicas plasmáticas 66-71 .
Sin embargo, las evidencias que relacionan directamente las grasas de la dieta con el riesgo cardiovascular son escasas y a menudo inconsistentes 72 . En particular, la capacidad de la dieta para explicar las variaciones geográficas y a lo largo del tiempo en el riesgo cardiovascular es limitada. En el caso de España, el consumo de grasas no parece explicar la distribución provincial de la enfermedad coronaria y la enfermedad cerebrovascular 5-8 . Asimismo en España, en los últimos 20 años se ha producido un descenso importante de la mortalidad por ambas enfermedades, que se ha acompañado, paradójicamente, por un progresivo deterioro de la dieta, fundamentalmente por el aumento de grasas saturadas en sustitución de los hidratos de carbono 73,74 .
Por último, tampoco está clara, en individuos seguidos fuera del ambiente controlado de los estudios metabólicos, la relación entre la dieta y el perfil lipídico plasmático 72 . En nuestro país, no parece coincidir la distribución geográfica de la ingesta de grasas, como se deriva de la Encuesta de Presupuestos Familiares de 1991 75 , con la distribución geográfica del perfil lipídico, registrada en el estudio DRECE 76 . Este estudio, sin embargo, pone de manifiesto perfiles lipídicos más favorables, especialmente fracciones HDL más altas, en el norte de España, la zona con menor mortalidad cardiovascular 76 .
Por todo lo anterior, es pertinente avanzar en el conocimiento de las relaciones entre la dieta, las fracciones lipídicas plasmáticas, y el riesgo cardiovascular en España, un país mediterráneo con una dieta todavía razonablemente saludable y un perfil lipídico sanguíneo menos favorable del que se espera por su bajo riesgo coronario. En concreto, el estudio 4P examinará la relación entre la dieta y el perfil lipídico en plasma de niños de 6-7 años. A continuación, establecerá la relación entre las anteriores y la mortalidad cardiovascular en la vida adulta, a nivel provincial. Asimismo dará información actualizada y de base poblacional sobre el perfil lipídico en niños de 6-7 años, comparable con la ya existente 77-82 . Por último, permitirá estudiar la relación comunitaria entre el perfil lipídico, en particular las lipoproteínas de alta densidad (HDL), y las concentraciones de antioxidantes en muestras sanguíneas y en la dieta. De hecho, existen evidencias de la correlación poblacional positiva entre la fracción HDL y algunos antioxidantes de la dieta, que no existen para el resto de los parámetros lipídicos (colesterol total, colesterol LDL o triglicéridos) 83 .