El genotipo D/D del gen de la enzima conversiva de la angiotensina como factor de riesgo de reestenosis post-stent coronario

INTRODUCCIÓN

La enzima conversiva de la angiotensina (ECA) tiene un papel importante en el metabolismo de dos péptidos vasoactivos, la angiotensina II (ATII) y la bradicinina. La formación de ATII, mediada por la ECA, ha sido implicada en la formación de neoíntima en la reestenosis postangioplastia desde hace al menos una década ¹ . Powell et al popularizaron el concepto de que la ATII, por su capacidad de aumentar la proliferación de las células musculares lisas, era un péptido clave en la formación de neoíntima ² . Diversos autores demostraron que el tratamiento con inhibidores de la ECA (IECA) disminuía significativamente el tejido de neoformación en diversos modelos animales de reestenosis. Sin embargo, ensayos clínicos a gran escala, como los estudios MARCATOR y MERCATOR ^3,4 , no demostraron que el uso de IECA disminuyera la incidencia de reestenosis postangioplastia. Se han invocado dos posibles teorías para explicar esta contradicción: a) la dosis de IECA usada en esos modelos animales fue muy superior a la que puede ser usada en humanos, y b) en humanos el mecanismo de reestenosis postangioplastia con balón sería fundamentalmente por estrechamiento del vaso, y no por proliferación celular ⁵ .

Si bien los stents , al suprimir el estrechamiento de la arteria, han logrado reducir la incidencia de reestenosis postangioplastia ⁶ , han creado una nueva entidad, la reestenosis intra- stent , en la cual el mecanismo parece depender exclusivamente de proliferación, migración de células musculares lisas y secreción de matriz extracelular. La reestenosis intra- stent es una entidad de difícil manejo ^7,8 , por lo cual la búsqueda de marcadores de reestenosis puede contribuir ya sea a restringir el uso de stents a ciertos pacientes, o a usar cierto tipo de terapia que pueda prevenir la formación de neoíntima en aquellos pacientes que aparezcan como susceptibles. En los últimos años se ha identificado al polimorfismo I/D del gen de la ECA como un potencial marcador de diversos eventos cardiovasculares, como infarto agudo de miocardio (IAM), hipertensión arterial y reestenosis postangioplastia con balón ^9,10 . Este polimorfismo se caracteriza por la presencia (I) o ausencia (D) de un fragmento de 287 pares de bases en el intrón 16 de este gen, localizado en el cromosoma 17q23 en humanos. El polimorfismo del gen de la ECA estaría asociado con la concentración plasmática de la ECA, caracterizada por una mayor producción de esta enzima tanto tisular como circulante en el caso del genotipo DD. El objetivo del presente trabajo fue estudiar la posible asociación que pudiera existir entre reestenosis intra- stent y el polimorfismo I/D del gen de la ECA.

MÉTODOS

Pacientes

Se estudiaron 48 pacientes que cumplieron los siguientes criterios: angioplastia coronaria transluminal percutánea (ACTP) con stent coronario electivo, lesión de novo en arteria nativa, resultado angiográfico óptimo y que tuvieran seguimiento angiográfico. La ACTP se realizó con técnicas habituales; los stents fueron implantados utilizando balones de alta presión, hasta obtener un resultado con estenosis residual inferior al 20%. En la tabla 1 se puede apreciar que las características basales de los pacientes con distintos genotipos (DD, ID o II) no difirieron significativamente entre sí. Los pacientes permanecieron en tratamiento con aspirina de forma indefinida, ticlopidina durante 4 semanas y se dejó a criterio de los médicos tratantes el uso de otros medicamentos, como ß-bloqueadores, antagonistas del calcio, hipolipemiantes u otros. La gran mayoría de los pacientes fueron tratados con antagonistas del calcio, y un reducido número de pacientes recibieron IECA (5-10 mg/día de enalapril) desde la angioplastia hasta la coronariografía de control.

Angiografía cuantitativa

La coronariografía y la angioplastia se efectuaron en un cineangiógrafo General Electric, y las películas fueron filmadas a 25 imágenes/s. Se eligieron las imágenes más representativos (postimplante de stent y en el seguimiento), para luego digitalizarlos por medio de un escáner Microteck Scanmaker IISp con módulo de transparencias, usando el programa PhotoShop 4.0 y un ordenador Macintosh Quadra. El módulo de transparencias permite escanear directamente la película de 35 mm, sin necesidad de realizar fotografías. Las imágenes fueron amplificadas hasta un tamaño de 700 kb (14 bit/píxel). Posteriormente se trasladaron al programa NIH-IMAGE. Tras amplificar nuevamente, se definió para cada imagen una escala según el patrón de referencia (catéter de angioplastia, o catéter diagnóstico) y se procedió a realizar las mediciones. Cada medición fue realizada en duplicado, según hemos descrito previamente ¹¹ .

Genotipo ECA

Extracción del ADN

Se recolectó una muestra de sangre en un tubo con EDTA pH 8,0, que fue centrifugada y se eliminó el sobrenadante; las células se resuspendieron en NaCl al 0,9% frío (4 °C), repitiendo hasta eliminar los glóbulos rojos. Posteriormente se agregó ADNzol para lisar los glóbulos blancos. Luego se procedió a extraer el ADN, resuspendiéndolo en NaOH.

PCR del gen de la ECA

Se utilizaron 2 µl del ADN extraído. Para el estudio de este polimorfismo se usó la técnica de Rigat et al ¹² . Los primers 5'-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3' y 5'-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3' fueron usados como sense y antisense , respectivamente. La PCR se realizó con una solución que contenía 2 µl del ADN extraído, 8 µl de dNTPs 1,25 mM, 1,5 µl MgCl ₂ 50 mM, 2 µl de sense (5 µM), 2 µl de antisense 5 µM, 1 µl Taq polimerasa 1U/µl, y tampón hasta completar 50 µl. La solución fue desnaturalizada a 94 °C durante 5 min. El termociclador (Perkin Elmer) fue programado con los siguientes ciclos: 94 °C durante 1 min, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 1 min, durante 30 ciclos, 72 ºC durante 10 min y posteriormente a 4 °C durante 10 min. Los productos de la amplificación fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa y luego fueron visualizados con bromuro de etidio y fotografiados. La calificación del polimorfismo fue realizada en duplicado desconociendo la presencia o la ausencia de reestenosis.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan en media ± error estándar. Las variables continuas fueron comparadas mediante la prueba de la t de Student para medidas independientes, mientras que las posibles diferencias entre las variables categóricas fueron analizadas mediante la prueba de la * ² .

RESULTADOS

Angiografía cuantitativa

Las causas de reestudio coronario en ambos grupos de pacientes fueron diversas. En el grupo con reestenosis se reestudiaron 17 pacientes por dolor torácico, 3 por IAM reciente, 1 por test de esfuerzo positivo y 1 por control electivo asintomático. De los pacientes sin reestenosis, 15 se reestudiaron por dolor torácico, 10 fueron controles asintomáticos y 1 por test de esfuerzo positivo. El tiempo promedio de reestudio fue 7,9 ± 1,2 meses en el grupo con reestenosis y de 6,5 ± 0,6 meses en el grupo sin reestenosis. Hubo 22 casos con reestenosis angiográfica, definida como estenosis superior al 50% del vaso de referencia por angiografía cuantitativa (tabla II).

Genotipo ECA

En la figura 1 se observa el aspecto típico de los diferentes genotipos descritos en este trabajo. Puede observarse que el alelo de inserción I se detecta como una banda a 490 pb, mientras que el alelo D se presenta como una banda de 190 pb. Los heterozigotos I/D expresan ambas bandas.

Del total de pacientes, el 22,9% (11/48) presentó genotipo D/D, el 14,5% (7/48) genotipo I/I y 30/48 (62,5%) presentó genotipo I/D.

En la tabla 3 se puede apreciar que el 81,8% (9/11) de los pacientes con genotipo D/D presentaron reestenosis, mientras que sólo el 14,2% (1/7) con genotipo I/I y el 40,0% (12/30) de los pacientes con genotipo I/D presentaron reestenosis angiográfica (p < 0,01).

DISCUSIÓN

En la reestenosis postangioplastia coronaria existen elementos característicos como la proliferación y la migración de células musculares lisas y/o de miofibroblastos desde la adventicia y capa media hacia la subíntima, seguidas de una gran acumulación de elementos de la matriz extracelular ¹³ ; entre ambas constituyen la neoíntima. Aunque ciertamente influyen fenómenos locales como el grado de agresión local, el tipo de angioplastia (balón, stent , rotablator, etc.), para el caso de la angioplastia coronaria es un hecho clínico evidente de que algunos pacientes, habiendo sido tratados de igual manera, evolucionan en forma muy diferente, algunos perfectamente (sin reestenosis) mientras que otros desarrollan una gran respuesta tisular, cuya manifestación es la reestenosis. Desde que se comprobó que la reestenosis era el punto débil de la angioplastia, se ha intentado identificar marcadores de riesgo de reestenosis para concentrar esfuerzos en aquellos pacientes más susceptibles de presentarla. Existen ciertos factores que han aparecido reiteradamente como predictores de reestenosis como el tamaño del vaso de referencia inferior a 2,7 mm, placas largas y diabetes mellitus. Varios otros factores han quedado descartados debido a que han demostrado su menor consistencia en distintos estudios.

Existen otras líneas de investigación que buscan marcadores genéticos que permitan seleccionar mejor las intervenciones que sean más adecuadas para determinados pacientes. Es muy posible que existan ciertas características hereditarias que predispongan al organismo a reaccionar frente a diversas agresiones, como el balón o el stent intracoronario. Esta diferente respuesta a la agresión se observa claramente en la gran variación que puede observarse en distintos sujetos en respuesta a una herida cutánea, que oscila desde una cicatrización perfecta en algunos individuos hasta la aparición de un queloide en otros. Poder identificar genes que influyen sobre estas respuestas puede ser de gran ayuda para seleccionar a los pacientes con mejores resultados frente a ciertas intervenciones, o que obliguen a tomar mayores precauciones para protegerlos de posibles evoluciones poco satisfactorias.

Recientemente se han publicado estudios que han implicado a variantes alélicas del gen de la ECA en diversas afecciones cardiovasculares como infarto de miocardio e hipertensión arterial ^9,14 . La explicación fisiopatológica parece estar relacionada con una mayor producción de ECA circulante y tisular en los pacientes que presentan el genotipo DD ¹⁵ . A su vez, la mayor disponibilidad de ECA permite una mayor producción de ATII, que es un potente estímulo para la proliferación de células musculares lisas y de síntesis de colágeno (centrales en reestenosis). Paralelamente, aumenta la degradación de bradicinina. Se ha descrito que ésta puede ejercer un papel inhibidor de la proliferación neointimal ¹⁶ .

En este trabajo encontramos que el 22,9% de los pacientes presentaba genotipo D/D, el 14,5% genotipo I/I y el 62,5% genotipo I/D. Esta frecuencia alélica es similar a la referida por Ribichini et al, en pacientes coronarios ¹⁷ . El hallazgo de que en nuestra población el 81,8% de los pacientes con genotipo D/D presentaron reestenosis es interesante. En el estudio de Ribichini et al la incidencia de reestenosis para este genotipo fue del 60,0% ¹⁷ . Sería necesario estudiar a un número mayor de enfermos para determinar si en la población chilena en particular la presencia de este marcador de riesgo es tan intensamente predictiva de reestenosis como se observa en nuestro estudio.

En todo caso nuestros hallazgos concuerdan con las de la bibliografía, de modo que se suman a diversas experiencias internacionales en el sentido de que efectivamente existiría una asociación entre la presencia de este marcador y la reestenosis postangioplastia ^18,19 . Es posible que esta asociación pueda ser un poderoso elemento de juicio respecto del uso de stents en estos pacientes. Alternativamente, estos pacientes podrían ser tratados en forma enérgica con IECA, intentando bloquear la producción de ATII, o con antagonistas de los receptores AT1 de la ATII, que son capaces de inhibir la actividad de ATII generada ya sea por acción de la ECA o por otras vías, incluyendo la cinasa intersticial ²⁰ , lo que confiere en teoría más posibilidades de éxito, al bloquear completamente el sistema en su efector final.

Es conveniente destacar que éste no es un estudio de la incidencia de reestenosis, sino que está dirigido a explorar algunos aspectos poco conocidos de pacientes con y sin reestenosis angiográfica. Una limitación de este trabajo consiste en que la mayoría de los pacientes fueron estudiados por presentar síntomas (aunque sólo la mitad de ellos efectivamente presentaron reestenosis), y que numerosos pacientes con stents no fueron incluidos por no contar con una coronariografía de control. A la luz de estos resultados, estamos realizando un estudio prospectivo en el que se analiza la incidencia de reestenosis en pacientes con distintos genotipos de la ECA en respuesta a bloqueadores de la ATII.

CONCLUSIONES

En suma, en esta población seleccionada, el genotipo D/D se asoció significativamente a mayor incidencia de reestenosis post- stent . Se requieren estudios a mayor escala y prospectivos para poder establecer de forma más definitiva a este criterio como un factor de riesgo de reestenosis post- stent .